soro do feto de feto descascado com carvão vegetal (ver também Ref. 3)
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adicionar 250 mg de carvão vegetal e 25 mg de dextrano T-70 a 100 ml de soro do feto de vitelo (CCS).incubar a 56 ° C durante 30 minutos.centrifugar a 3000-4000 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente.transferir o sobrenadante para baldes frescos.
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repetir os passos anteriores.
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filtrar o sobrenadante através de um pré-filtro (tipo AP; Millipore, Bedford, MA) para remover carvão vegetal.filtrar a solução através de um 0.,Filtro de tamanho de poros de 45 µm (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).conservar alíquotas a -20°C. gelatina (10 × estoque)
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fazer uma solução de gelatina a 1% (M/v) (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
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Autoclave durante 20 minutos.conservar a 4°C. pratos/frascos revestidos com gelatina diluir o stock de gelatina 10 vezes.Pipetar esta solução nos pratos para cobrir completamente a superfície da cápsula (1, 5 a 2 ml por prato de 6 cm).deixar os pratos durante 2 horas à temperatura ambiente. Para acelerar este procedimento, podem ser colocados na incubadora a 37 ° C durante 1 hora.,aspira os pratos.embalar as placas em folha de alumínio e armazená-las à temperatura ambiente ou a 4°C. tampão de HEBS (10× matéria-prima)
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adicionar água destilada dupla a 975 ml.Ajuste o pH para 7, 05 e o volume para 1000 ml.
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Autoclave a solução e guarde-a a 4°c.
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antes de utilizar, adiciona-se ao tampão uma solução de glucose filtrada (ver preparação de 2× HEBS).
HEBS (2×)
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diluir a H2o 10× stock cinco vezes com H2O estéril.
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Adicionar 0, 2 ml de uma solução de glucose filtrada (1 g/ml) por 100 ml (concentração final, 10 mM).,Ajuste o pH para 7.05-7.08. Este passo é crucial para a formação do complexo Ca–DNA.4 esterilizar a solução por filtração.
Phosphate-buffered saline (PBS) sem cálcio e magnésio (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
Normal médio: Preparado com não-inactivadas pelo calor FCS e médio com fenol vermelho
Esteróide-esgotado médio: Preparada com carvão despojado FCS e meio, sem o vermelho de fenol. Este meio só é utilizado quando o efeito das hormonas, normalmente presentes no soro, deve ser testado.,
Quantidade de plasmídeo utilizado por transfection
Repórter de plasmídeo de construir, de 6,5 µg
vetor de Expressão, 1,0 µg
Expressão plasmidial como um controle para transfeccao de eficiência, de 0,5 µg
Quando a quantidade total de DNA é menos de 8 a 10 µg, portador (DNA plasmidial ou arenque ADN do esperma) deverá ser adicionado a fim de obter uma boa Ca–DNA precipitado
tampão de Lise