1 Introdução
proteínas integrais de membrana constituem uma grande proporção dos genomas de muitos organismos—aproximadamente 25% do genoma humano—e realizam uma gama diversa de funções, incluindo passos-chave na comunicação de uma célula com o seu ambiente., Devido à sua importância biológica e terapêutica (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), as proteínas de membrana são o foco da investigação Biofísica fundamental e aplicada para caracterizar estruturas tridimensionais, dinâmicas e interações em ambientes nativos.,
Solução-estado de espectroscopia de RMN tem desempenhado um papel fundamental na membrana proteínas de estudos biofísicos, como o site-specific dinâmica e interação com as informações fornecidas por tais abordagens bem complementa os dados estruturais obtidos a partir de difração de raios X, cryo-EM, e análises computacionais (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Fundamental para tais estudos são vários 2D “impressão digital espectros,” mais frequentemente 15N/1H HSQC (heteronuclear single quantum coherence) espectros (para backbone de amida mais Trp, Asn, e Gln sidechains) ou metil 13C/1H HMQC (heteronuclear multiple-quantum coherence) espectros de alimentação de grupos metil (Pellecchia et al., 2008). Estes experimentos dirigidos a metil são especialmente vantajosos para grandes complexos proteicos/lipídicos de membrana lenta; experimentos dirigidos a outros locais de sidechain e mainchain também foram aplicados com sucesso., Experimentos de RMN podem fornecer informações sobre a proteína dinâmica ao longo de muitos prazos, a partir rápida (ps ns) alimentação de movimentos lentos conformacional alterações (µs–ms) (Kasinath, Sharp, & Varinha, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Varinha, Moorman, & Harpole, 2013)., Muitas destas dinâmicas, experiências, muitas vezes usando a alimentação de grupos metila como sondas, foram adaptados e desenvolvidos para grandes biomolecular de sistemas e pode ser usado para proteínas de membrana (Rosenzweig & Kay, 2014; Sol, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
uma vantagem particular da RMN do estado da solução é que as proteínas são estudadas em um estado de solução nativo, onde elas podem interconvert entre várias conformações., No entanto, as proteínas membranares devem ser solubilizadas numa membrana adequada mimética que mantenha a estrutura e dinâmica nativas. Diferentes opções incluem detergente micelas, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, e vesículas lipídicas, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cruz, 2013). Muitas vezes é necessário testar diferentes estratégias de solubilização para uma dada amostra de proteína para estabilidade, intensidade do sinal e resolução, e estrutura/atividade nativa., Duas considerações importantes para todos os miméticos de membrana são (1) Um Tamanho de partículas uniforme e pequeno e (2) uma grande extensão de deuteração.
a deuteração de alto nível, tanto dentro da membrana mimética como da própria proteína, é fundamental para reduzir o número de sinais 1H presentes nos espectros (incluindo os de lípidos, que podem ser intensos) e para melhorar as características de relaxamento das restantes curvas NMR activas na amostra., Enquanto a deuteração é possível para a membrana mimética através da compra/síntese de compostos deuterizados, substituir 1H por 2H em proteínas requer incorporação biossintética. Para experimentos de espinha dorsal em sistemas de expressão eucariótica, pode-se rotular uniformemente com 15N para observar todos os amidas (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) ou através da adição de aminoácidos especificamente rotulados (Isogai et al., 2016)., Para os grupos metila, pode-se fornecer aminoácidos apropriadamente rotulados ou precursores de aminoácidos (particularmente ácidos alfa-ceto) para meios de crescimento para acessar vários padrões de rotulagem nas sidechains de vários aminoácidos (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucina δ1 grupos metil particularmente útil (1) a abundância de Ile de resíduos integral proteínas de membrana, incluindo Broadband (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) o far upfield 13C mudança de isoleucina δ1 grupos metil , colocando-os em um particularmente despovoada região de 2D 13C/1H os espectros, (3) a falta de necessidade de stereospecifically atribuir esses grupos metil, ao contrário do Val e Leu, e (4) a presença de vários, rodar livremente em laços entre o grupo metil e proteína espinha dorsal, proporcionando substancial independência da dinâmica desses sites (Kasinath et al.,, 2013).embora muitas das estratégias de rotulagem acima mencionadas tenham sido bem desenvolvidas para a E. coli, muitas proteínas integrais da membrana só podem ser expressas em níveis elevados em hospedeiros eucarióticos. Entre estas, a levedura metilotrófica Pichia pastoris é um hospedeiro conveniente para a expressão heteróloga e a rotulagem isotópica das proteínas da membrana eucariótica (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Vantagens de Pichia incluem rapidez de manipulação genética, alto rendimento de proteína recombinante, a existência de posttranslational modificação (PTM) e acompanhante máquinas necessárias para eucarióticas proteínas de membrana, e a capacidade para crescer no mínimo definido de mídia, permitindo perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). A rotulagem isotópica uniforme em Pichia foi bem estabelecida (Morgan et al., 2000; Pickford & O’Leary, 2004)., Nós estendemos este trabalho demonstrando o 13C, 1H etiquetagem de grupos isoleucina δ1-metil em um fundo perdeuterado, adicionando α-cetobutirato etiquetado (~ 50% de etiquetagem, ~ 90% de deuteração) para meios de crescimento altamente deuterizado (Clark et al., 2017, 2015). Em contraste, a rotulagem simultânea de grupos de leucina δ-e valina γ-metil Com α-ketoisovalerato é ineficiente, mas pode ser alcançada adicionando valina rotulada diretamente ao meio de crescimento ou modificando as condições de cultura (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia pode facilmente levar até adicionais aminoácidos da mídia, com uma correlação entre a absorção de eficiência e o custo energético para sintetizar aminoácidos tipo de novo (Heyland, Fu, em Branco, & Schmid, 2011). No entanto, após a captação nas células, aminoácidos rotulados podem ser alimentados em vias metabólicas (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), diluindo o sinal de aminoácidos desejados e complicando a análise de dados por baralhamento isotópico., Alternativamente, podem ser desenvolvidas estirpes auxotróficas para a rotulagem de um aminoácido específico; no entanto, deve ter-se o cuidado de confirmar que não se verificam efeitos fora do alvo noutras vias metabólicas (Whittaker, 2007).
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados necessários para gerar tais proteínas integrais de membrana u-2h (13C, 1H-Ile δ1 metil) marcadas por sobre-expressão em Pichia, usando o receptor de adenosina A2A humana como um sistema modelo., Detalhamos ainda como essas amostras podem ser usadas em estudos NMR de solução, desde a aquisição de espectros simples de 13C / 1H HMQC, através de atribuições de deslocamento químico por mutagênese direcionada no local, até a análise de medições de relaxamento cruzado 1H–1H de rápida dinâmica de sidechain.