Geneticamente encodable bioluminescente sistema de fungos

o gene h3h mostrou semelhança de sequência com 3-hidroxibenzoato 6-monooxigenases, enzimas que catalisam oxidação de 3-hidroxibenzoato usando NADH e oxigénio molecular. Esta reacção é idêntica à que converte a hispidina em luciferina(Fig. 1A); thus, we hypothesized that h3h gene codes for hispidin-3-hydroxylase( H3H), the enzyme corresponding to the predicted hydroxylase (15)., Clonámos o gene de N. nambi e descobrimos que as colónias de P. pastoris que expressam nnluz e nnh3h emitem luz quando pulverizadas com o precursor de luciferina hispidina, ao contrário das colónias de controlo que expressam apenas nnluz (Apêndice SI, figos. S14 e S17)—confirmando que nnh3h converte hispidin em luciferina.

o gene hips (Fig. 1C) codifica um membro da família da poliquetida sintase, enzimas que produzem metabolitos secundários em uma variedade de organismos através da árvore da vida (20)., Polyketide synthases normalmente, adicionar malonyl metades para o crescimento da cadeia de carbono; portanto, o α-pyrone natureza de hispidin sugeriu que sua biossíntese pode ser realizada por um polyketide sintase de ácido caféico por dois ciclos de adição de malonyl unidades, seguido por lactonization (Fig. 1A E SI Appendix, Fig. S3). Grandes poliquetainas modulares requerem modificações pós-transferacionais para sua atividade (21), tais como a transferência de um grupo fosfopanteteinil para um resíduo de serina conservado do domínio de proteína Carrier acil., Para testar se hisps gene pode produzir luciferina precursor em um heterologous sistema integrado hisps, nnluz, e nnh3h genes em conjunto com o Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl transferase npgA no genoma de P. pastoris. Quando cultivadas num meio contendo ácido cafeico, leveduras que exprimem todos os quatro genes emitiram luz vista a olho nu (Fig. 3A), embora não tenha sido observada produção de luz significativa em estirpes sem genes npgA ou hips (Apêndice SI, figos. S15 e S17)., Portanto, hisps cataliza a síntese da hispidina do ácido cafeico, fechando a cadeia de reações (o” ciclo do ácido cafeico”) a partir de um metabolito celular comum com biossíntese conhecida para uma luciferina eucariótica.

em algumas espécies bioluminescentes de fungos,o aglomerado genómico acomoda um ou dois genes adicionais (Fig. 1C): um pertencente à família do citocromo P450 e o outro pertencente à família das hidrolases de fumarilacetoacetato., Este último (cph) provavelmente codifica uma hidrolase de caffeilpiruvato (Dataset S4) envolvida na reciclagem da oxiluciferina, consistente com o cafeilpiruvato, a oxiluciferina fúngica, sendo hidrolisada em cafeato e piruvato por uma hidrolase presente em extractos brutos fúngicos (22).

a Conservação do gene cluster sugere que, em contraste com outros grupos de organismos bioluminescentes (23), a bioluminescência evoluiu em fungos apenas uma vez, com luz, h3h, e hisps genes emergentes através de duplicações do gene. Reconstructed phylogenetic trees for luz, h3h, and hips genes (SI Appendix, Figs., S4-S6) e a árvore da ordem Agaricales (Fig. 2) reveal the evolution of the bioluminescence cascade in fungi. A principal enzima luz da cascata de bioluminescência fúngica emergiu através de uma duplicação de genes na base de Agaricales seguida pela duplicação de h3h e hisps alguns milhões de anos depois. Curiosamente, muitas espécies em um grande clado que codifica hisps são não-bioluminescentes, e os homólogos hisps em espécies bioluminescentes carecem de dois domínios, os domínios cetoredutase e desidratatase(si Appendix, Fig. S6)., É provável que a perda destes domínios funcionais no ancestral comum das espécies bioluminescentes favoreceu a produção de α-pironas por his ancestrais, possivelmente fornecendo o passo final para o surgimento da bioluminescência.Fig. 2. Phylogeny of Agaricales species in which genomes are sequenced. Os retângulos com os nomes dos genes indicam onde luz, h3h, e hisps genes surgiram como resultado da duplicação. Um clado oval na bioluminescência (BL) indica o ancestral comum de todas as espécies bioluminescentes., As cruzes vermelhas marcam os ramos da árvore que eventualmente perderam a bioluminescência. As linhagens de fungos bioluminescentes também são mostradas no mesmo clado. A escala estima o número de substituições por local.

O gene cluster continuou a evoluir dinamicamente após a aquisição da bioluminescência. Pelo menos seis eventos independentes de perda total ou parcial de genes do aglomerado genómico levaram à perda secundária de bioluminescência (Fig. 2). O gene cph foi inserido no aglomerado no clado não-magnóide, possivelmente duas vezes (Fig. 1)., Este padrão de mosaico assemelha-se à história evolutiva das proteínas fluorescentes (24), outra família proteica visualmente relevante com um papel biológico pouco claro, e pode indicar que a vantagem seletiva proporcionada pela bioluminescência nos fungos depende de um contexto ecológico específico ou transitório.as adaptações complexas podem ser uma fonte de soluções biotecnologicamente relevantes., Além de revelar a natureza dos processos fotoquímicos básicos e a evolução das proteínas, as luciferases estão entre os principais tipos de genes de repórter utilizados em vários oleodutos de pesquisa, métodos de diagnóstico e aplicações ambientais (5, 6, 25). Para determinar se uma via bioluminescente fúngica pode fornecer genes repórter, Nós caracterizamos nnLuz in vitro e testamos sua capacidade de produzir luz em sistemas heterólogos.

a proteína nnLuz consiste em 267 aminoácidos e tem a massa molecular de cerca de 28,5 kDa (Apêndice SI, Fig. S7)., Embora a sua localização celular in vivo permaneça desconhecida, a proteína tem uma helix transmembranar N-terminal prevista, consistente com a colocalização da actividade da luciferase com fracções celulares insolúveis em estudos anteriores (22). Quando expresso em P. pastoris, nnLuz foi associado à fracção microssómica (apêndice SI, Fig. S8) e emitiu luz verde com um máximo de 520 nm e espectro idêntico ao de N. nambi micélio (Fig. 3A e SI Apêndice, Fig. S9). O nnluz recombinante emite luz de forma óptima a cerca de pH 8.,0 e temperaturas moderadas, perdendo a sua actividade a temperaturas superiores a 30 ° C (SI Apêndice, Fig. S10).Fig. 3. luciferase fúngica como gene repórter. (A) Photo of P. pastoris cells expressing nnluz, nnh3h, nnhisps, and npgA genes growing in a medium containing caffeic acid. A foto foi tirada em uma câmera NIKON D800, ISO 1600, exposição 8 S. (B) células humanas HEK293NT cotransfectadas com luciferase fúngica (canal verde) e Katushka proteína fluorescente vermelha (canal Violeta). A luciferina fúngica foi adicionada ao meio até à concentração final de 650 µg/mL antes da aquisição da imagem., (C) Imagem de um rato com s.c. injetado murino de carcinoma de células CT26 expressando um nnluz (à esquerda) ou P. pyralis luciferase (à direita), depois eu.p. a administração de uma mistura de fungos (0,5 mg) e firefly (0,5 mg) luciferins. A cor indica a intensidade da luz emitida. D) expressão do gene nnluz num embrião X. laevis. O embrião direito foi microinjetado com a mistura de rhodamina lisina dextrano e nnluz mRNA na fase de duas células, e então, foi microinjetado com luciferina na cavidade blastocoel na fase gastrula., Como um controle, o embrião esquerdo foi microinjetado com rhodamina lisina dextrano apenas na fase de duas células, e então, também foi microinjetado com luciferina na cavidade blastocoel na fase gastrula. O canal Violeta indica fluorescência de rodamina, e o canal verde indica bioluminescência de nnLuz.

Para testar o potencial de nnluz como um gene repórter em heterologous sistemas, testamos a sua expressão em Escherichia coli, P. pastoris, início de Xenopus laevis embriões e células humanas., Embora a luciferase se tenha acumulado principalmente em corpos de inclusão quando expressa em bactérias(Apêndice SI, Fig. S7), todas as células e organismos testados que expressavam nnluz de tipo selvagem eram claramente bioluminescentes quando a 3-hidroxispidina foi adicionada ao meio (Fig. 3 e si Apêndice, figos. S11 e S22). Também comparámos a nnLuz qualitativamente com a luciferase do firefly Photinus pyralis numa imagem de corpo inteiro de xenografts de tumores em ratinhos. We S. C., implantaram quantidades iguais de células do carcinoma do cólon Murino que expressam nnluz ou a pirilampo luciferase sob o mesmo promotor, injectaram uma mistura de pirilampo e luciferinas fúngicas I. p.e obtiveram sinais quase idênticos dos implantes (Fig. 3C).

finalmente, visamos testar se a biossíntese da luciferina pode ser alcançada em organismos sem biossíntese do ácido cafeico. Introdução de três genes adicionais que codificam enzimas da biossíntese do ácido cafeico da tirosina, Rhodobacter capsulatus tirosina amoníaco e dois E., coli 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase componentes (26), no genoma da estirpe P. pastoris transportando genes npgA, hisps, h3h e luz, resultou numa estirpe que foi autonomamente bioluminescente quando cultivada num meio padrão de levedura (apêndice SI, figos. S12 and S16).assim, sob todas as condições testadas, a Nambi luciferase é funcional em sistemas heterólogos, posicionando-se como um gene repórter promissor, e a luciferina fúngica pode ser sintetizada a partir de aminoácidos aromáticos em outros eucariotas., Além disso, a luciferina fúngica é um composto solúvel em água e permeável em células, e sua reação de emissão de luz não depende da disponibilidade de ATP, tornando o sistema bioluminescente fúngico atraente para inúmeras aplicações em imagens Biomédicas. Além disso, vários análogos de luciferina podem ser usados para melhorar a emissão de luz e sintonizar seus espectros, melhorando a penetração de luz em aplicações de imagens de tecidos profundos (22).em conclusão, apresentamos a cascata enzimática que leva à emissão de luz nos fungos, que é um sistema de bioluminescência eucariótica com biossíntese conhecida da luciferina., Mostrou-se que a luciferina é sintetizada a partir do seu precursor hispidin por N. nambi H3H e que hispidin pode diretamente ser sintetizados pelo hispidin sintase do ácido caféico, uma generalizada celular metabólito com eficiente biossíntese do que foi alcançado em diversos organismos, incluindo industrialmente relevantes estirpes de levedura (26)., Apenas dois enzimática passos dos principais vias metabólicas, o fungal sistema tem um alto potencial para a biologia sintética para criar autonomamente brilhante animais e plantas: as tentativas de desenvolvimento de tais organismos têm até agora sido prejudicada pelo fraco desempenho em eucariotas das bactérias bioluminescentes sistema, o único sistema para o qual luciferina biossíntese era conhecido (27, 28).reconstituição da via bioluminescente fúngica em organismos eucarióticos pode permitir aplicações em que tecidos ou organismos comuniquem alterações no seu estado fisiológico com emissão de luz Autónoma., Poderá também impulsionar o desenvolvimento da próxima geração de arquitectura orgânica (29), onde as plantas brilhantes geneticamente modificadas serão integradas em edifícios e infra-estruturas urbanas. Além disso, com a sua intrigante história evolutiva, uma família de luciferases, e simplicidade geral, o sistema bioluminescente fúngico aqui apresentado é um recreio molecular que oferece inúmeras oportunidades para a investigação básica e aplicada.,