… o BactoScan FC baseado, que usa brometo de etídio para manchar bactérias no leite, fornece um resultado após 8 minutos (5, 30). Uma técnica de fluxo – citométrica para medir o TBC em leite cru e ultra – quente com o sistema de coloração BC também foi descrita anteriormente (16). No entanto, estas técnicas ou são muito específicas, detectando apenas uma espécie, ou não específicas, detectando todas as bactérias., Não foram ainda descritas técnicas citométricas de fluxo para a diferenciação de bactérias no leite em grupos maiores, tais como bactérias gram-positivas e gram-negativas. A coloração de Gram foi inicialmente descrita em 1883 pelo colega de Christian Gram, Carl Friedlander, dividindo bactérias em dois grupos, e novamente em 1884 por Christian Gram (12, 14). O procedimento convencional de coloração de Gram inclui as manchas violeta de cristal e safranina. Células fixas ao calor em uma lâmina são manchadas azul-violeta com violeta de cristal, e depois, eles são tratados com etanol., As bactérias Gram-negativas são descolorizadas pelo etanol, enquanto as bactérias gram-positivas permanecem manchadas com violeta cristal. A safranina é usada para combater bactérias gram-negativas, dando a este grupo uma aparência rosa. Várias abordagens alternativas para identificar a reação de Gram foram relatadas. Um método no qual uma colônia de bactérias é submetida a 3% de hidróxido de potássio é amplamente utilizado. A alta concentração de hidróxido de potássio lises bactérias gram-negativo, liberando DNA das células, o que pode ser confirmado puxando uma corda viscosa da colônia (15, 26)., Foi descrita uma técnica alternativa de coloração Gram com uma aglutinina de gérmen de trigo da lectina conjugada com fluoresceína (WGA) para a epifluorescência combinada e um microscópio de contraste de fase (29). A WGA liga – se à N-acetilglucosamina na camada pep-tidoglicana da parede celular. As bactérias gram-negativas têm uma camada de lipopolissacarídeo que cobre a parede celular e é por isso que não estão manchadas com WGA, enquanto as bactérias gram-positivas estão manchadas com WGA, uma vez que não têm uma camada de lipopolissacarídeo., Estes resultados mostraram uma insensibilidade à idade da cultura, o que implicou que esta mancha poderia ser usada diretamente em amostras sem pré-cultura da amostra. Uma versão modificada da técnica WGA foi descrita para bactérias encontradas em um ambiente não alimentar em que as bactérias são imobilizadas em um lter fi, lavadas, e depois manchadas com WGA (11). Algumas técnicas de coloração de Gram para a citometria de Flow também foram propostas. Um usa a mancha lipofílica uorescente rho – Damina 123, que mancha selectivamente bactérias gram-positivas., A camada lipopolissacarídica de bactérias gram-negativas pré-ventila a entrada de rhodamine 123 (1, 28). Outra técnica similar combina as duas manchas fluorescentes de ligação de DNA, SYTO 13 e iodeto de hexídio (HI). O SYTO 13 é uma mancha permeável à membrana, e o HI é bloqueado pela camada lipopolissacarídica de bactérias gram-negativas e, portanto, apenas permeável a bactérias gram-positivas e gram-negativas com uma camada lipopolissacarídea des – estabilizada (22). No entanto, devido à natureza frágil da camada lipopolissacárida, estas técnicas não são consideradas adequadas para amostras não cultivadas., O objectivo do presente trabalho tem sido desenvolver uma técnica de coloração de Gram baseada na coloração de bactérias com WGA e HI E seguida de detecção por citometria de Flow. A técnica foi avaliada em bactérias associadas ao leite (19, 20) na fase Sta-tionária e após 6, 12 e 48 h de incubação em meio labo – ratório. Além disso, o método foi testado em culturas em fase de Estação – ary que foram armazenadas durante 24 horas a 18 ° C e durante 14 dias a 5 ° C. finalmente, a técnica foi aplicada ao leite de tanque a granel enriquecido com bactérias conhecidas., Uma técnica de diferenciação de bactérias gram-positivas e gram-negativas no leite de tanque a granel, sem pré-cultura, será a última aplicação. A figura 1 mostra o efeito da concentração de KCl na ligação de WGA às bactérias gram-positivas M. luteus E S. uberis , quando as bactérias são manchadas apenas por WGA, excluindo HI. Nos histogramas, o ruído é visto à esquerda, onde os Eventos com baixa intensidade de FL urescência se acumularam (uma debulha antiga foi usada para cortar a maior parte do ruído)., Quando as bactérias são manchadas de forma eficaz para distingui-las do ruído, elas aparecerão como um pico completamente separado do ruído. Usando 0 m KCl, nenhuma das duas bactérias foi manchada o suficiente para separá-las do ruído. Utilizando 1 m KCl, observou – se um aumento da intensidade de FL uores-cência para ambas as bactérias. M. luteus foi então separado do ruído, e S. uberis apenas um pouco exagerou o ruído. O aumento da concentração de KCl para 3 M melhorou ainda mais a ligação (intensidades de fluorescência mais elevadas) da WGA a estas estirpes de bactérias, especialmente para M. luteus ., Observações microscópicas demonstraram que as bactérias gram-positivas eram manchadas por WGA, enquanto que as bactérias gram-negativas não eram manchadas por WGA. O HI manchou tanto a bactéria gram – positiva como a gram-negativa. A figura 2 mostra um exemplo da coloração de uma mistura (1:1) do luteus gram-positivo e da E. coli gram-negativa com WGA e HI. Como resultado da coloração, M. luteus apareceu com uma superfície verde (WGA) e um citoplasma vermelho (HI), enquanto E. coli apareceu apenas com um citoplasma vermelho. Parcelas isométricas de análises flow cyto-métricas de culturas de E. coli, M., luteus, e uma mistura (1:1) Destes são mostrados na Fig. 3. E. coli medida isoladamente (Fig. 3A), 100% dos eventos estiveram presentes na região gram-negativa. Apenas para M. luteus (Fig. 3B), 99% dos eventos foram na região gram-positiva e 1% dos eventos entraram na região gram-negativa. Quando as culturas de E. coli e M. luteus foram misturadas (Fig. 3C), 50% dos eventos foram observados em cada região. Cada uma das 12 estirpes bacterianas foi medida em duplicado após 6,12, 24 e 48 h de incubação. A partir de cada medição, 100 eventos foram usados para cálculos. Em Fig., 4 é apresentada uma parcela montada que inclui todos os 800 eventos para cada uma das 12 estirpes bacterianas testadas durante 48 h de incubação (um total de 9 600 eventos). Cada estirpe bacteriana é apresentada com uma cor distinta. Apresenta-se uma melhor linha calculada para a separação de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Globalmente, a linha assegurou que 97% dos eventos fossem interpretados corretamente. As percentagens de células correctamente interpretadas para cada uma das estirpes foram reduzidas e são apresentadas no quadro 1. Para E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus, S. aureus, S. agalactiae, S., dis-galactiae e S. uberis , quase todas as células (Ͼ 96%) foram correctamente interpretadas para qualquer período de incubação. Para B. cereus , P. fl uores – cens , e P. putida , Ͼ 93% das células foram interpretados corretamente após 12 e 24 h de incubação, enquanto que após 6 e 48 h de incubação de apenas 75 a 89% das células foram interpretados corretamente. No quadro 2, são apresentados os resultados das análises flow – citométricas de culas submetidas a diferentes condições de armazenagem., Quando as culturas foram armazenadas a 5 ° C durante 14 dias, a técnica de coloração parecia estar na moda pela idade da cultura, especialmente para bactérias gram-negativas. A percentagem média de células correctamente interpretadas foi de 86%. Para E. coli, M. luteus, S. agalactiae, S. dysgalactiae , E S. uberis, a maioria das células ( Ͼ 97%) foram correctamente interpretadas. Para B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis , E S. aureus , 76 a 89% foram interpretados corretamente, e para P. fl urescens e P. putida , os números fi foram 58 e 68%, respectivamente., A congelação não pareceu in flu – rar a técnica de coloração. Após o armazenamento em Ϫ 18 ° C durante 24 h, Ͼ 98% das células foram interpretados corretamente para E. cloacae , E. coli , K. oxi – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae e S. uberis . Para B. cereus e P. fl urescens , as percentagens foram de 83% e 82%, respectivamente. A figura 5 mostra as parcelas isométricas de “fl ow-cytometric anal – yses” de S. aureus e E. coli adicionadas ao leite de tanque a granel. Para S. aureus (Fig. 5A), 98% dos eventos foram na região gram-positiva e 2% dos eventos entraram na região gram-negativa., Para E. coli (Fig. 5 B), 96% dos eventos foram na região gram – negativa e 4% dos eventos entraram na região gram-posi – tive. A contribuição das bactérias naturais presentes no leite representava menos de 0,1%. A adição de uma elevada concentração de KCl à solução de coloração melhorou a capacidade da WGA para manchar bactérias gram-positivas. Uma possível explicação é que bactérias gram-positivas têm ácidos teicóicos ligados perpendicularmente às suas paredes celulares, o que, para algumas bactérias gram-positivas, pode bloquear o acesso de WGA à parede celular., Quando a concentração de KCl é baixa, a estrutura dos ácidos teicóicos é rígida, mas ao aumentar a concentração de KCl, a estrutura será solta à medida que os íons de potássio eliminam as cargas negativas sobre os ácidos teicóicos, causando o colapso da estrutura (8, 9). A composição e a estrutura dos ácidos teicóicos variam entre as espe-cies gram – positivas (24), O que pode explicar por que razão um aumento da concentração de KCl de 1 para 3 M teve um efeito maior no luteus do que na S. uberis . No presente trabalho, 3 M KCl foi usado para maximizar a ligação de WGA a bactérias gram-positivas., As técnicas de eliminação da organização dos ácidos teicóicos têm sido relatadas de forma pré – viosa apenas para aplicações microscópicas. Estas técnicas incluem a utilização de FOL – lol de tetróxido de ósmio pulverizado por adição e evaporação de acetona (2) e a irradiação térmica de bactérias numa lâmina microscópica (29). No entanto, estes tratamentos não puderam ser considerados no presente estudo, uma vez que um passo de desidratação não é adequado para a citometria flow., A técnica de coloração de Gram mostrou resultados confiáveis para todas as estirpes após 6, 12, 24 e 48 h de incubação, para a qual quase todas as células (97%) foram interpretadas corretamente. Estes resultados correspondem às conclusões do método de coloração de Gram WGA re-portado …