Antagonismo entre a penicilina e eritromicina contra Streptococcus pneumoniae in vitro e in vivo

Resumo

A combinação de β-lactâmicos e macrolídeos é frequentemente recomendada para o tratamento empírico inicial de pneumonia aguda, a fim de obter a atividade contra os mais importantes patógenos. Teoricamente, esta combinação pode ser inexplicável, uma vez que o agente bacteriostático pode antagonizar o efeito do agente bactericida., Neste estudo, a interação possível entre a penicilina e eritromicina foi investigada in vitro e in vivo contra quatro isolados clínicos de Streptococcus pneumoniae com MICs de penicilina, que vão desde 0.016 a 0,5 mg/L e de eritromicina 0,25 >128 mg/L. In vitro de tempo de matar as curvas foram geradas com clinicamente relevantes concentrações de penicilina (10 mg/L) e eritromicina (1 mg/L), individualmente ou em combinação. Foi observado antagonismo entre a penicilina e a eritromicina nos quatro isolados., A interacção In vivo foi investigada no modelo de peritonite do Ratinho. Após inoculação intraperitoneal, a penicilina e a eritromicina foram administradas individualmente ou em combinação. Para dois dos quatro isolados, a mortalidade foi significativamente mais elevada nos grupos tratados com a associação de penicilina e eritromicina do que nos grupos tratados apenas com penicilina . Utilizando o modelo de peritonite do rato, as curvas in vivo do tempo–morte mostraram que havia antagonismo entre a eritromicina e a penicilina para o isolado examinado., O antagonismo demonstrado in vitro e in vivo entre a penicilina e a eritromicina sugere que os antibióticos β-lactâmicos e os macrólidos não devem ser administrados em conjunto, a menos que se exclua a infecção pneumocócica.

Introdução

é um desafio escolher o direito de terapia para pacientes com pneumonia, como a etiologia não pode ser previsto com base nos sintomas e achados clínicos sozinho, e um final diagnóstico microbiológico tem, normalmente, não foi estabelecido antes do tratamento começar., Streptococcus pneumoniae é o organismo mais frequentemente isolado em pneumonia adquirida na comunidade, especialmente em crianças pequenas e pacientes mais velhos, e a infecção ainda carrega uma alta mortalidade.No entanto, infecções por Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae e Legionella spp. são também comuns 2, 3 e estes organismos geralmente não são sensíveis aos agentes antimicrobianos comumente utilizados para o tratamento de pneumococos. Assim, a penicilina ou outras β-lactamas são frequentemente recomendadas em combinação com eritromicina para o tratamento empírico inicial da pneumonia aguda de etiologia desconhecida.,Anteriormente, foi demonstrada sinergia in vitro e in vivo entre antibióticos β-lactâmicos, tais como penicilina, ampicilina, piperacilina e cefuroxima, quando combinados com gentamicina contra S. pneumoniae.Foi demonstrado antagonismo in vitro para associações como a ampicilina e o cloranfenicol contra o Haemophilus influenzae7 e contra o streptococci do grupo B.,Foram notificados antagonismos clinicamente importantes entre a penicilina e a tetraciclina contra pneumococos,9,10 penicilina e eritromicina contra estreptococos do Grupo A e ampicilina, estreptomicina e cloranfenicol na meningite bacteriana aguda.12, Teoricamente, o empírico inicial de tratamento da pneumonia com uma combinação de um beta-lactam agente e um macrolídeo também pode ser inexpedient no caso de infecção pneumocócica, como o macrolídeo bacteriostático pode antagonizar o efeito bactericida da β-lactam.,no presente estudo investigámos a possível interacção in vitro entre a penicilina e a eritromicina contra quatro isolados clínicos de pneumococos com várias susceptibilidades à penicilina e à eritromicina.Estudámos interacções in vivo no modelo de peritonite do rato.6 Materiais e métodos

bactérias, meios e condições de crescimento para o modelo de peritonite do Ratinho

as suspensões bacterianas a utilizar como inóculo para testes in vitro e in vivo foram preparadas a partir de culturas overnight frescas em placas de ágar de sangue de 5% feitas a partir de culturas de reserva congeladas., O inóculo para as experiências com ratos, foi preparada imediatamente antes da inoculação suspendendo-se as colônias de estéril Mueller–Hinton caldo (Statens Serum Institut, Copenhaga, Dinamarca) e foi ajustado para uma densidade óptica a 540 nm de 0,5–1,0, dando uma concentração de c. 108 ufc/mL, conforme descrito anteriormente.13 para cada experiência, o tamanho do inóculo foi determinado após a realização de 10 diluições em caldo Mueller-Hinton, das quais 20 µL foram banhadas em duas placas de ágar de 5% em manchas de sangue em duplicado, com subsequente Contagem de colónias após incubação de um dia para o outro a 35°C no ar., Mucin (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), um extracto enzimático do estômago de suíno, foi utilizado como adjuvante para a inoculação dos ratinhos e foi preparado como solução-mãe a 10% (M/v) em solução salina.Imediatamente antes da inoculação, as soluções de mucina foram diluídas 1:1 com suspensões pneumocócicas, dando uma concentração final de mucina de 5% (M/v).

os medicamentos utilizados foram a penicilina G (Leo Pharmaceutical Co., Ballerup, Dinamarca) e eritromicina (Sigma Chemical Co.). A penicilina G foi diluída em solução salina tampão fosfato 6, 5 ± 0.,1, e a eritromicina foi diluída em 9 mL de água estéril e 1 mL de álcool a 96%; o pH da solução de eritromicina foi ajustado entre 6, 7 e 7, 3.os microfones

e os microfones

foram determinados pelo método de macrodilução do caldo em tubos de vidro. Todos os testes foram realizados em duplicado e os resultados foram lidos após 20 h de incubação a 35°C. O método de macrodilução dos caldos em tubos de vidro foi efectuado com caldo de Mueller–Hinton (Statens Serum Institut), ao qual foram adicionados 5% de sangue de ovelha; foi utilizado um inóculo de 106 ufc/mL., A penicilina G foi diluída em duas etapas no caldo Mueller– Hinton para obter concentrações de 0, 004–64 mg/L. A menor concentração de antibiótico na qual não houve crescimento visível foi tomada como CMI. Usámos S. pneumoniae ATCC 49619 como estirpe de controlo para os testes MIC.

o hemograma foi determinado por subcultura de tubos sem crescimento visível após a determinação da CIM. De cada tubo, foram cultivados 100 µL em placas de ágar contendo penicilinase (Leo Pharmaceutical Co.) Foram contadas 1000 UI/placa e Colónias após 18-24 h de incubação a 35 ° C., O hemograma foi definido como a menor concentração de penicilina que reduziu o inóculo em ≥99, 9%. Todos os ensaios foram realizados em duplicado.para estudar possíveis interacções entre a penicilina e a eritromicina, foram realizados ensaios de eliminação temporal com concentrações clinicamente relevantes de penicilina e eritromicina de 10 e 1 mg/L., Antes das experiências de eliminação do tempo, o isolado 86 (resistente à eritromicina) foi cultivado em placas de ágar de 5% do sangue contendo 4 mg/L de eritromicina (indução da resistência à eritromicina) e em placas sem eritromicina (não indução da resistência à eritromicina). O pneumococos (106 ufc/mL) foram incubados em 20 mL de caldo Mueller–Hinton a 35°C com agitação. Para garantir o crescimento exponencial das bactérias, os antibióticos foram adicionados pela primeira vez após 1 h de incubação. Foram colhidas amostras antes da adição de antibióticos e 1, 2, 3 e 5 h mais tarde., As curvas de tempo-morte não foram estendidas mais, uma vez que a autólise começou a ocorrer após 5-6 h para todos os isolados. Os números de ufc/mL foram determinados após a realização de diluições adequadas, tendo-se espalhado 100 µL em placas de ágar de sangue a 5%. Para amostras não diluídas, foram utilizadas placas de ágar contendo penicilinase (como acima). As colónias foram contadas após 20 h de incubação a 35 ° C. Todas as experiências de abate de tempo foram realizadas em duplicado. A variação do número de colónias nos mesmos pontos de tempo para experiências repetidas foi 0, 5 log10 por mL., O antagonismo foi definido como um efeito de occisão significativamente diminuído (ou seja, >0, 5 log10 ufc/mL de 1 a 5 h após a adição de medicamentos) da combinação de penicilina e eritromicina, em comparação com a penicilina isolada.14

nas experiências de eliminação no tempo, determinámos possíveis alterações de pH nos frascos com tiras de ensaio de pH (intervalo de pH 4.5–10.0; graduado em 0,5 unidades de pH; Sigma Chemical Co.).todas as experiências com animais foram aprovadas pelo Comité Nacional de ética animal Dinamarquês., Fêmeas com mais de 8-12 semanas de idade, foram utilizados 28-30 g de peso, em grupos de cinco a 36 ratinhos. No total, usámos 88 ratinhos para isolar 73, 89 ratinhos para isolar 75, 88 ratinhos para isolar 86 (sem indução), 94 ratinhos para isolar 86 (induzidos com eritromicina como para estudos de tempo–morte) e 89 ratinhos para isolar 93. Os ratos foram mantidos em gaiolas com cinco a sete ratos por gaiola; lhes foi permitido acesso livre a comida e água. A suspensão pneumocócica (0, 5 mL) foi inoculada intraperitonealmente através de uma seringa de calibre 25., O inóculo continha 106 ufc/mL com 5% (M / v) de mucina no caldo Mueller–Hinton. Usando este tipo de inóculo, existe uma mortalidade de cerca de 100% em ratinhos não tratados, que sucumbem 36-48 h após inoculação. Foram administrados antibióticos por via subcutânea na região do pescoço num volume de 0, 25 mL por dose.Foi utilizado o seguinte esquema: a eritromicina foi administrada 90 minutos após a inoculação bacteriana e no grupo de associação foi administrada eritromicina 90 minutos após a inoculação bacteriana e penicilina 60 minutos depois. A penicilina foi administrada isoladamente durante 150 minutos após inoculação bacteriana., Foram administrados aos ratos de controlo 90 minutos de solução salina estéril após inoculação bacteriana.as Doses de penicilina e eritromicina foram escolhidas de acordo com as curvas de efeito de dose da equação de Hill, de tal forma que se espera que a penicilina isolada resulte em cerca de 95% de sobrevivência, enquanto que a eritromicina isolada previne a mortalidade em 10% dos ratinhos. Os ratinhos infectados com o isolado 73 foram tratados com penicilina 10 mg/ ratinho e/ou eritromicina 100 µg/ratinho. Os ratinhos infectados com isolado 75 foram tratados com penicilina 2 mg/ratinho e/ou eritromicina 100 µg/ratinho., Os ratinhos infectados com o isolado 86 (Não induzido) foram tratados com penicilina 150 µg/ ratinho e/ou eritromicina 100 µg/ratinho. Os ratinhos infectados com o isolado 86 (cultivados na presença de concentrações sub-inibitórias de eritromicina antes da inoculação) foram tratados com penicilina 150 µg/ratinho e/ou eritromicina 100 µg/ratinho. Os ratinhos infectados com isolado 93 foram tratados com penicilina 400 µg/ratinho e/ou eritromicina 100 µg/ ratinho.foram obtidas amostras de sangue de

através de cortes orbitais após anestesiar os ratinhos com CO2., Os ratos foram mortos e as lavagens peritoneais foram então efectuadas injectando 2 mL de solução salina intra-peritoneal estéril, massajando o abdómen e abrindo o peritoneu para recolher o fluido.15 amostras de sangue e fluido peritoneal foram imediatamente diluídas e 0,1 mL foram banhados em placas de ágar de sangue a 5%.as curvas In vivo de tempo–morte foram construídas para um dos isolados de pneumococos (número 93), que mostrou antagonismo significativo in vivo. Foram obtidos pneumococos no peritoneu e no sangue após inocular 36 ratinhos intra-peritonealmente com 5, 0 × 106 ufc/mL de suspensão bacteriana., Dez minutos, 80 min, 140 min, 3 h e 5 h após a provocação, foram mortos grupos de três ratos de controlo (inoculados com solução salina estéril). Aos 140 minutos, 3 h e 5 h após provocação, foram mortos grupos de três ratinhos tratados com eritromicina 90 min após provocação. Às 3 h e 5 h após provocação, grupos de três ratinhos tratados com a combinação de penicilina e eritromicina ou penicilina isoladamente 150 minutos após a infecção intraperitoneal terem sido mortos. Foram colhidas amostras de sangue e de lavagem peritoneal para cultura quantitativa de pneumococos.,

Determinação de ED50 da penicilina para o indivíduo pneumococos

O ED50, a dose única, conferindo proteção para 50% dos ratos, para cada pneumococo isolar foi determinado através do tratamento de grupos de cinco ratos com a duplicação das doses de antibióticos; a sobrevivência dos ratos foi observada por 7 dias. Um grupo de cinco ratos tratados com 0, 9% de NaCl foi incluído em cada experiência como um controle para a letalidade da infecção. Para cada isolar o ED50 foi calculado pelo método de Reed & Muench16 e a partir da equação de Hill (GraphPad Prism; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Nós não realizamos nenhum experimento para calcular a eritromicina ED50, uma vez que isto foi feito anteriormente para estirpes com microfones similares em nosso laboratório.Escolhemos doses de penicilina que seriam esperadas como resultado numa sobrevivência estimada em 95% dos ratinhos e doses de eritromicina que seriam esperadas como resultado numa sobrevivência estimada em 10% dos ratinhos. Para a terapêutica combinada, os antibióticos foram administrados em injecções separadas.o teste exato de Fisher para dados categóricos foi usado, com um nível de significância de 5%.,

resultados

os microfones da penicilina e da eritromicina e a ED50s da penicilina para as quatro estirpes pneumocócicas são apresentados na tabela. A infecção letal foi atingida com três dos quatro isolados. No entanto, a ED50 de penicilina para isolar 86 tem de ser estimado, pois só foi possível atingir 90% de mortalidade no ED50 determinação experimentos.

os resultados das experiências de morte no tempo são mostrados na Figura 1., Por este método, todos os isolados mostraram antagonismo in vitro para a combinação de penicilina e eritromicina (figura 1a–C E e) porque a eritromicina inibiu quase completamente o efeito bactericida da penicilina. No entanto, quando a resistência à eritromicina foi induzida pelo crescimento do isolado resistente à eritromicina (número 86) nas placas de ágar do sangue contendo 4 mg/L de eritromicina antes do estudo de eliminação do tempo, o antagonismo à eritromicina foi neutralizado (figura 1d).

para todos os isolados, o efeito de occisão in vitro da penicilina e da penicilina mais eritromicina aumentou com o tempo., A diminuição na UFC observada nos frascos de controlo em algumas experiências foi devida a autólise, uma observação comum com pneumococos. Em todas as experiências, a eritromicina isolada demonstrou um efeito de occisão menor do que a penicilina e a combinação. Não se observou qualquer efeito de occisão durante as 5 horas de incubação na estirpe resistente à eritromicina, incubada ou não com eritromicina. Não se observaram alterações no pH nos frascos contendo um ou ambos os antibióticos: o pH foi de 7, 5 após 0, 1, 2, 3, 4 e 5 h de incubação.,no modelo de peritonite do rato, descobrimos que o tratamento combinado da penicilina e eritromicina resultou em antagonismo em ratinhos desafiados com isolados 75 e 93 (figura 2b e e). Lá foi significativamente maior mortalidade em ratos tratados com eritromicina 60 min antes da penicilina do que em camundongos tratados com penicilina sozinho (a isolar 75: mortalidade 32/36 e 3/12, respectivamente, P < 0.05; isolar 93: a mortalidade 24/36 e 3/12, respectivamente, P < 0.05) (Figura 2)., Nos restantes dois isolados, a mortalidade nos ratinhos aos quais foram administrados os dois antibióticos foi semelhante à dos ratinhos aos quais foi administrada penicilina isoladamente (figura 2a e d). Todos os ratos de controle morreram quando infectados intraperitonealmente com pneumococos, exceto ratos infectados com isolado 86, para o qual a mortalidade foi de 80-90%. Mesmo quando o inóculo bacteriano do isolado 86 foi aumentado para 108 ufc/mL, não houve mortalidade de 100%.

As taxas de mortalidade mais baixas foram observadas nos grupos de ratinhos tratados apenas com penicilina ou eritromicina mais penicilina em associação após provocação bacteriana., A mortalidade mais elevada foi observada entre ratinhos de controlo ou ratinhos tratados com eritromicina em monoterapia durante 90 minutos após infecção pneumocócica (Figura 2). Para isolar 86 descobrimos que o tratamento combinado desde significativamente melhor proteção contra a infecção pneumocócica que o tratamento com penicilina sozinho após 150 min (32/35 ratos no primeiro grupo sobreviveu em comparação com 6/12 na última; P = 0,009) ou eritromicina sozinho (32/35 e 16/36 de sobrevivência, respectivamente; P = 0,005) (Figura 2c)., Quando eritromicina resistência foi induzida antes da inoculação com a isolar 86, o tratamento combinado desde significativamente melhor proteção do que a eritromicina sozinho (31/36 ratos no primeiro grupo sobreviveu em comparação com 5/36 na última; P = 0,005).

O in vivo de tempo de matar curvas para isolar 93 mostrou um 1-2 registo de aumento no crescimento de bactérias no sangue de 80 min após o desafio, em comparação com 10 min após desafio para o controle de ratos (Figura 3), enquanto o número de pneumococos em peritoneal lavagens de 80 min foi o mesmo que 10 min após a inoculação., O número de pneumococos cultivados a partir de sangue e de lavagem peritoneal em diferentes pontos temporais nos diferentes grupos de tratamento foi quase paralelo, com uma ufc/mL 1-2 log mais elevada em lavagem peritoneal do que no sangue. O abate de bactérias foi mais eficiente no grupo tratado com penicilina, com uma diminuição no crescimento bacteriano de 3 logs e 4 logs no sangue e lavagem peritoneal, respectivamente. A terapêutica de associação demonstrou um efeito semelhante no crescimento bacteriano, tal como quando a eritromicina foi administrada isoladamente (antagonismo).,

discussão

a interacção entre a eritromicina e a penicilina contra o pneumococos foi estudada com quatro isolados com diferentes susceptibilidades à penicilina ou à eritromicina. In time–kill curvas para a eritromicina sensível isolar (Figura 1a, b e e) mostrou claro antagonismo entre as duas drogas, por exemplo, a presença de eritromicina completamente inibido a atividade bactericida da penicilina e a curva resultante foi semelhante à lentidão de atividade inibitória da eritromicina sozinho., A inibição do efeito da penicilina (que é ácida) pode ter sido devida a aumentos de pH causados pela eritromicina (que é alcalina). O efeito antagonista também foi observado no isolado pneumocócico resistente à eritromicina não induzido (86), enquanto a indução da expressão do gene de resistência à eritromicina impediu o efeito inibitório da eritromicina e a sua actividade antagonista na penicilina., Estes resultados indicam claramente que é a atividade inibitória dos macrolídeos sobre o crescimento ou a divisão celular das bactérias, que é a principal razão para o antagonismo contra a penicilina, que só pode agir sobre bactérias que estão em fase de crescimento e produção de uma célula de parede.Esta actividade bacteriostática da eritromicina e o seu efeito inibitório na penicilina foram claramente evidentes nos ensaios in vivo.,

para avaliar a possível interacção entre os dois fármacos in vivo, escolhemos o modelo de peritonite do rato,que foi anteriormente útil na demonstração da interacção entre os antibióticos 6 e que também permite estudar a acção do fármaco sobre as bactérias através da realização in vivo de experiências de morte Temporal em organismos no peritoneu e/ou sangue.17 Doses de penicilina e eritromicina foram escolhidas de acordo com as curvas de efeito de dose da equação de Hill sigmoid, de tal forma que se esperaria que a penicilina isolada resultasse em C., 95% da sobrevivência, enquanto a eritromicina isolada só seria capaz de prevenir a mortalidade em 10% dos ratinhos. Com estas doses, um efeito da dose de eritromicina sem influência de uma dose subsequente de penicilina resultaria numa mortalidade determinada unicamente pela actividade do macrólido. A actividade Antagonista dos dois fármacos foi subsequentemente confirmada, pelas curvas de tempo–morte in vivo, devido à mesma actividade inibidora do crescimento da eritromicina, como demonstrado in vitro., A importância da indução de resistência a eritromicina na eritromicina resistente a isolar (número 86) também foi demonstrada in vivo: a indução com eritromicina diminuiu significativamente a sobrevivência, apesar de eritromicina tratamento em comparação com a sobrevivência seguinte eritromicina tratamento de uninduced pneumococos.com um isolado susceptível à eritromicina (número 73), não foi possível demonstrar antagonismo in vivo com o método utilizado. Pode haver várias explicações para isso., A possibilidade de nem todos os pneumococos responderem de forma semelhante aos dois fármacos utilizados parece improvável, especialmente quando a actividade foi igualmente demonstrável in vitro. É mais provável que a situação in vivo é diferente para as diferentes estirpes, por exemplo, a virulência do pneumoccci depende de uma série de fatores que são difíceis de padronizar, tais como o tipo e o tamanho da cápsula, outros fatores de virulência conectado com a membrana ou toxinas, ou o crescimento comportamento in vivo, o que é muito variável de pneumococos., É provável que pudéssemos ter demonstrado antagonismo in vivo com o isolamento 73 se tivéssemos “titulado” o inóculo e o tempo dos dois medicamentos em relação uns aos outros, mas isso exigiria um número excessivo de animais., A clara demonstração da interação entre as duas drogas contra pelo menos duas cepas de pneumococos, tanto in vitro e in vivo, o que foi demonstrado pelo aumento na mortalidade, bem como pelas alterações na in vivo de tempo de matar curvas, é ampla evidência para um efeito, e deve alertar os clínicos contra a utilização destes dois medicamentos juntos para tratar infecções pneumocócicas.

o significado clínico do antagonismo entre um fármaco bactericida como a penicilina ou a ampicilina e um inibidor da síntese bacteriostática de proteínas, p. ex., a tetraciclina, eritromicina ou cloranfenicol, foi demonstrada em vários estudos.O antagonismo de 7-12,18 foi confirmado in vivo num estudo experimental com penicilina e cloranfenicol contra a meningite pneumocócica em cães.Apesar desta experiência inicial com tais combinações de fármacos, recomenda-se a combinação de penicilina e eritromicina, mesmo nos livros-texto padrão como tratamento empírico em pneumonia de etiologia desconhecida.A combinação de fármacos é particularmente escolhida para abranger pneumococos e Legionella spp.,, que são considerados importantes e mortais agentes etiológicos em pneumonia. É difícil saber se os resultados do presente estudo são diretamente aplicáveis à situação clínica. Na situação clínica, as doses sub-óptimas de eritromicina não seriam normalmente utilizadas, mas, com a acção inibida da penicilina, poderá ser necessário recorrer ao efeito bacteriostático da eritromicina, se o pneumoccus for susceptível à eritromicina. Não se sabe se o efeito indutível da eritromicina demonstrado no presente estudo também ocorre no foco pneumónico em seres humanos.,em conclusão, o presente estudo demonstrou antagonismo entre a penicilina e a eritromicina contra três isolados sensíveis à eritromicina de pneumococos in vitro. Este antagonismo também ocorreu com dois dos isolados in vivo num modelo experimental simples com ratinhos. Quando a resistência à eritromicina não foi induzida, o antagonismo também foi demonstrado in vitro para o isolado pneumocócico resistente à eritromicina, mas a indução com eritromicina antes da inoculação obliterou o efeito antagonista.