Clostridium difficile ist ein sporenbildender anaerober nosokomialer Erreger, der mit leichtem bis lebensbedrohlichem Durchfall oder Kolitis assoziiert ist (1, 2). C. difficile Kolonisation nimmt mit der Dauer des Krankenhausaufenthalts nach Umweltbelastung durch Sporen oder Kontakt mit einer infizierten Person zu (3). Es wurde über Kontamination und Überleben von C. difficile-Sporen auf unbelebten Oberflächen im Krankenhaus berichtet (4, 5) und es wurde gezeigt,dass sie mit einer Kreuzübertragung verbunden sind (6, -8).,
Die Inaktivierung und Tilgung von Clostridium difficile-Sporen stellt eine Herausforderung dar, und es wurden mehrere relativ neue Techniken wie Wasserstoffperoxiddampf, UV-Strahlung oder gasförmige Plasmasysteme untersucht (5, 6, 9, 10). Die Validierung solcher Techniken sollte optimale Wiederherstellungsmethoden verwenden, um die Abtötung oder Tilgung von Bakteriensporen besser zu quantifizieren.
Eine Vielzahl von Methoden wurde verwendet, um C. difficile aus der Krankenhausumgebung mit variablen Ergebnissen zu erkennen (11, 12). Hier berichten wir über eine Auswertung verschiedener Methoden zur Erkennung und Wiederherstellung von C., difficile Sporen aus Materialien, die häufig in der Krankenhausumgebung gefunden werden.
(Vorläufige Daten aus dieser Studie wurden auf dem Europäischen Kongress für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten, Barcelona, Spanien, Mai 2014 als Poster präsentiert.)
Ein C. difficile Referenzstamm, ATCC 700057 (Cruinn Diagnostics, Irland) und ein uncharakterisiertes klinisches Isolat (Diagnostic Laboratory, Beaumont Hospital, Dublin, Irland) wurden in die Studie einbezogen. Eine Modifikation des von Chilton et al.beschriebenen C. difficile-Sporenpräparationsprotokolls. verwendet wurde (13). Kurz, C., difficile wurde in prereduced Brain Heart Infusion, ergänzt mit Hefeextrakt und L-Cystein, inkubiert, 48 h lang anaerob bei 37°C inkubiert und auf 10 Columbia-Blut-Agar-Platten (Oxoid, Vereinigtes Königreich) verteilt, die 10 Tage lang anaerob bei 37°C inkubiert wurden (14). Das Wachstum wurde mit einem Zellschaber von den Platten gesammelt und in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Ethanol (50%) suspendiert. Die Suspensionen wurden bei Raumtemperatur für 1 h mit periodischem Mischen inkubiert., Sporensuspensionen wurden für 10 min bei 16.000 × g zentrifugiert, und die Pellets wurden in 1 ml PBS resuspendiert. Sporenzahlen und Reinheit wurden mittels Mikroskopie mit dem Schaeffer und Fulton Spore Stain Kit (Sigma-Aldrich, Irland) bestimmt. Suspensionen wurden auf eine Konzentration von ungefähr 105 KBE/ml eingestellt (eine Kolonie entspricht einer Spore), und serielle 1:10-Verdünnungen wurden in PBS hergestellt.
C., difficile Sporensuspensionen (50 µl) im Bereich von 105 bis 10 KBE/ml wurden in zweifacher Ausfertigung zu 25 cm2-Abschnitten aus Polyurethan-Matratzengewebe (Meditec Medical, Irland), Polypropylen (GoodFellow Cambridge, Ltd., Vereinigtes Königreich) und Edelstahl, alle wie zuvor beschrieben dekontaminiert (15). Die auf die Oberflächen aufgebrachten Sporensuspensionen wurden über 2 h luftgetrocknet. Die Oberflächen wurden mit vorgefertigten Rayon-Tupfern und Nylon-beflockten Tupfern (Copan, Italien) abgetastet und in 3 ml PBS gegeben. Serielle Verdünnungen der Tupfersuspensionen wurden auf präparierte C. difficile selektive Platten—C-beimpft., difficile Agar base CM0601 plus C. difficile supplement SR0096 (250 mg/Liter d-Cycloserin, 8 mg/Liter Cefoxitin) und 7% (vol/vol) defibriniertes Pferdeblut (SR0050)—bereitgestellt von Oxoid zur Aufzählung von CFU/ml. Sterile Kontaktplatten (VWR) wurden im Labor mit C. difficile Selective Agar gegossen und 20 s lang auf jeden Abschnitt aufgetragen, um einen festen Kontakt mit der Oberfläche zu gewährleisten. Subkulturierte Platten aus Tupfern und Kontaktplatten wurden über Nacht anaerob bei 37°C inkubiert., Die Nachweisgrenze (LOD) wurde definiert als die niedrigste Konzentration von Sporen, die mit einer bestimmten Methode nachgewiesen wurde. Alle Methoden wurden unabhängig vom gesamten Abschnitt bewertet und ihre Fähigkeiten zur Erkennung und Wiederherstellung von C. difficile-Sporen verglichen. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 5.00-Software durchgeführt. Das Mittel von drei unabhängigen Experimenten, der Prozentsatz der Wiederherstellung, die für die verschiedenen Methoden analysiert wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey ‚ s multiple comparison test.,
1983 zeigte einer der ersten Berichte, in denen Methoden zur Rückgewinnung von C. difficile-Sporen aus einer Umweltglasoberfläche verglichen wurden, dass Kontaktplatten von Tupfern, Klebepaddeln und Kontaktplatten bei weitem die effizienteste Methode waren, Sporen auf niedrigem Niveau nachzuweisen, einfacher zu verwenden und relativ schnell zu sein (16). Seitdem wurden verschiedene Methoden, einschließlich Tupfer, Kontaktplatten, Handschuhe und Schwämme, für Forschungs-und Ausbruchsuntersuchungen mit variablen Ergebnissen verwendet. Hier zeigen wir, dass Kontaktplatten die höchste Rückgewinnung von C erreicht haben., difficile Sporen (14% bis 92%) von verschiedenen Oberflächen, einschließlich Matratzenmaterial, Polypropylen und Edelstahl, bestätigen und erweitern die Ergebnisse von Buggy et al. (16) zur Rückgewinnung aus Glas. Die Rückgewinnung war auch für beflockte Tupfer effizient (14% bis 76%), und die am wenigsten effiziente Methode war der Rayon-Tupfer (7% bis 58%) (Abb. 1A und andB).B). Der Rückgewinnungsprozentsatz war direkt proportional zur Größe des anfänglichen Inokulums—dh ein Inokulum von 105 KBE/ml ermöglichte es den Kontaktplatten, bis zu 92% und für ein 10 KBE/ml-Inokulum nur 14% zurückzugewinnen., Kontaktplatten waren auch am empfindlichsten beim Nachweis von Sporen bei einer Mindestinokulation von 10 KBE/ml, während die LOD 102 KBE/ml für beflockte Tupfer und 103 KBE / ml für Rayon-Tupfer betrug, dies galt jedoch nur für das klinische Isolat. Statistisch gesehen waren Kontaktplatten für das klinische Isolat besser als beflockte Tupfer auf Polypropylen (P < 0.05) (Tabelle 1) und Rayon-Tupfern dauerhaft überlegen (P < 0.05 bis P < 0.001) (Tabelle 1), während es keinen signifikanten Unterschied zwischen beflockten und Rayon-Tupfern gab., Obwohl die statistische Analyse keinen signifikanten Unterschied in den Rückgewinnungen zwischen allen untersuchten Oberflächen ergab, waren die Rückgewinne aus dem Matratzenmaterial im Vergleich zu den anderen beiden Oberflächen leicht reduziert. Darüber hinaus wurde kein statistischer Unterschied zwischen den beiden Isolaten gesehen.
Prozentuale Rückgewinnung von Clostridium difficile-Sporen des Referenzstammes (A) und des klinischen Isolats (B) aus drei Umgebungsoberflächen unter Verwendung von Kontaktplatten, beflockten Tupfern und Rayon-Tupfern., Fehlerbalken repräsentieren die Standardfehler der Mittel (SEM) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten (n ≥ 3).,“1″> P-Wert aus statistischer Analyse ofa:
C., difficile Sporen können sowohl von asymptomatischen als auch von symptomatischen Patienten an die Umwelt abgegeben werden und können auf unbelebten Oberflächen bis zu 5 Monate überleben (17). Sie widerstehen den bakteriziden Wirkungen der meisten Krankenhausdesinfektionsmittel und der meisten anderen Dekontaminationstechniken (18). Daher sollten Eingriffe in Räumen überwacht werden, die derzeit oder zuvor von C. difficile-Trägern belegt sind. Die Berichterstattung über verbesserte Methoden in Bezug auf Geschwindigkeit und Empfindlichkeit, wie die hier berichtete Kontaktplatte und beflockte Tupfer, gibt eine genauere Schätzung des C., difficile Belastung im Vergleich zu zuvor gemeldeten Methoden. Angesichts der Tatsache, dass C. difficile die bekannteste Endospore im heutigen Gesundheitswesen ist und ein erhebliches Infektionsrisiko für gefährdete Patienten darstellt, besteht ein wachsender Bedarf, die C. difficile-Sporenkontamination im Gesundheitswesen genau zu quantifizieren. Dies würde dazu dienen, neue Dekontaminationsmethoden zu bewerten und die Kontaminationsgrade der Umwelt mit dem Infektionsrisiko und dem Auftreten von Ausbrüchen zu korrelieren., Nichtsdestotrotz ist die Verbesserung der akzeptierten Wiederherstellungsmethoden unter Verwendung von Materialien, die die im Krankenhaus gefundenen darstellen, eine notwendige Voraussetzung.