PMC (Norsk)

TEKST

Clostridium difficile er en spore-forming anaerob nosokomiale patogen forbundet med mild til livstruende diaré eller kolitt (1, 2). C. difficile kolonisering øker med lengden på sykehusopphold følgende miljømessig eksponering til sporer eller ta kontakt med en infisert person (3). Forurensning og overlevelse av C. difficile sporer på sykehus livløse overflater har blitt rapportert (4, 5) og er vist å være assosiert med cross-overføring (6,-8).,

Inaktivering og utrydding av Clostridium difficile sporene er en utfordring, og flere relativt nye teknikker har blitt undersøkt, slik som hydrogen peroxide damp, UV-stråling, eller i gassform plasma-systemer (5, 6, 9, 10). Validering av slike teknikker du bør bruke for optimal utvinning metoder for å bedre kvantifisere bakteriell spore drap eller utrydding.

En rekke metoder har blitt brukt til å oppdage C. difficile fra sykehuset miljø med variable resultater (11, 12). Her rapporterer vi en evaluering av ulike metoder for å oppdage og gjenopprette C., vanskelig sporer fra materialer som vanligvis finnes i sykehusmiljø.

(Foreløpige data som fremkommer fra denne studien ble presentert som en poster på den Europeiske Kongressen i Klinisk Mikrobiologi og Infeksjonssykdommer, Barcelona, Spania, Mai 2014.)

En av C. difficile referanse belastning, ATCC 700057 (Cruinn Diagnostikk, Irland), og en uncharacterized kliniske isolere (Diagnostisk Laboratorium, Beaumont Hospital i Dublin, Irland) ble inkludert i studien. En endring av C. difficile spore forberedelse protokollen beskrevet av Chilton et al. ble brukt (13). Kort, C., difficile ble inokulert i prereduced brain heart infusion supplert med gjær ekstrakt og l-cystein, inkubert anaerobically ved 37°C i 48 t, og fordelt på 10 Columbia blod agar plater (Oxoid, Storbritannia), som ble inkubert anaerobically ved 37°C i 10 dager (14). Veksten var samlet inn fra platene ved hjelp av en celle skrape og suspendert i 1 ml fosfat-fosfatbufret saltløsning (PBS)–etanol (50% ). Den suspensjoner ble inkubert ved romtemperatur i 1 t med periodisk blanding., Spore suspensjoner var sentrifugerte for 10 min på 16 000 × g, og pellets ble resuspendert i 1 ml PBS. Spore tall og renhet var bestemt av mikroskopi ved hjelp av Schaeffer og Fulton spore flekken kit (Sigma-Aldrich, Irland). Suspensjoner ble justert til en konsentrasjon på ca 105 CFU/ml (en koloni er tilsvarende en spore), og seriell 1:10 fortynninger ble utarbeidet i PBS.

C., vanskelig å spore suspensjoner (50 µl), alt fra 105 til 10 CFU/ml, ble lagt i duplikat 25 cm2 deler av polyuretan madrass trekk (Meditec Medisinsk, Irland), polypropylen (GoodFellow Cambridge, Ltd., Storbritannia) og rustfritt stål, alle dekontamineres, som beskrevet tidligere (15). Spore suspensjoner påføres overflater var luft tørket over 2 h. Overflatene ble prøvetatt ved hjelp av premoistened rayon vattpinner og nylon strømmet vattpinner (Copan, Italia) og plassert i 3 ml PBS. Serielle fortynninger av pinnen suspensjoner var inokulert på prepoured C. difficile selektiv plater—C., vanskelig agar-base CM0601 pluss C. difficile supplement SR0096 (250 mg/liter d-cycloserine, 8 mg/liter cefoxitin) og 7% (vol/vol) defibrinated hest blod (SR0050)—levert av Oxoid for opplisting av CFU/ml. Sterilt kontakt plater (VWR) ble strømmet i laboratoriet med C. difficile selektiv agar og brukes til hver seksjon for 20 s, noe som sikrer fast kontakt med overflaten. Subcultured plater fra både vattpinner og kontakt plater ble inkubert over natten anaerobically ved 37°C. Koloni opplisting ble utført dagen etter., Den deteksjonsgrense (LOD) ble definert som den laveste konsentrasjon av sporer brukes som ble oppdaget av en bestemt metode. Alle metoder ble vurdert uavhengig målrettet deg mot hele avsnitt, og deres evner til å oppdage og gjenopprette C. difficile spores ble sammenlignet. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5.00 programvare. Det betyr av tre uavhengige eksperimenter i prosent av utvinning for de ulike metodene som ble analysert av en-veis analyse av varians (ANOVA) og Tukey ‘ s multiple comparison test.,

I 1983 en av de første rapportene for å sammenligne metoder for utvinning av C. difficile sporer fra et miljømessig glasset viste at av pensler, lim og årer, og ta kontakt med plater, ta kontakt med platene var langt den mest effektive metoden å oppdage sporene på lave nivåer, være enklere å bruke og relativt rask (16). Siden da, ulike metoder, inkludert vattpinner, ta kontakt med plater, hansker og svamper, har blitt brukt til forskning og utbrudd undersøkelser med variable resultater. Her viser vi at kontakt plater oppnådd den høyeste recovery av C., vanskelig sporer (14% til 92%) fra ulike overflater, inkludert madrass materiale, polypropylen, og rustfritt stål, som bekrefter og utvider resultatene fra Buggy et al. (16) for gjenvinning av glass. Oppgangen var også effektiv for strømmet vattpinner (14% til 76%), og minst effektive metoden var rayon pinnen (7% til 58%) (Fig. 1A og andB).B). Oppgangen var andelen direkte proporsjonal med størrelsen av den opprinnelige inokulat—det vil si, en av inokulat 105 CFU/ml tillatt kontakt platene til å gjenopprette så mye som 92% og så lite som 14% for en 10-CFU/ml inokulat., Kontakt platene var også mest følsomme på å oppdage sporene på et minimum av inokulat 10 CFU/ml, mens deteksjonsgrensen 102 CFU/ml for strømmet til pensling og 103 CFU/ml for rayon vattpinner, men dette var bare sant for de kliniske isolere. Statistisk kontakt platene var bedre enn strømmet vattpinner på polypropylen for klinisk isolere (P < 0.05) (Tabell 1) og vedvarende overlegen rayon vattpinner (P < 0,05 til P < 0.001) (Tabell 1), mens det var ingen signifikant forskjell mellom strømmet til og rayon vattpinner., Selv om statistisk analyse ikke avsløre noen betydelig forskjell i inngang mellom alle overflater studert, den tilbakeføringer fra madrass materiale var litt redusert i forhold til de to andre overflater. Videre, ingen statistisk forskjell var sett mellom de to isolater.