Motsetningen mellom penicillin og erytromycin mot Streptococcus pneumoniae in vitro og in vivo

Abstrakt

kombinasjonen av β-lactam antibiotika og makrolider er ofte anbefalt for initial empirisk behandling av akutt lungebetennelse, for å få aktivitet mot de mest viktige patogener. Teoretisk sett er denne kombinasjonen kan være inexpedient, som bakteriostatisk agent kan motvirke effekten av den baktericid agent., I denne studien, mulig interaksjon mellom penicillin og erytromycin ble undersøkt in vitro og in vivo mot fire kliniske isolater av Streptococcus pneumoniae med Mikrofoner av penicillin alt fra 0.016 til 0,5 mg/L og av erythromycin fra 0,25 til >128 mg/L. In vitro-tid–drepe kurver ble generert med klinisk relevante konsentrasjoner av penicillin (10 mg/L) og erytromycin (1 mg/L), enten individuelt eller i kombinasjon. Motsetningen mellom penicillin og erytromycin ble observert for de fire isolater., In vivo-interaksjon ble undersøkt i musen peritonitis modell. Etter intraperitoneal grader, penicillin og erytromycin ble gitt enten enkeltvis eller i kombinasjon. For to av de fire isolater, dødeligheten var betydelig høyere i gruppene behandlet med kombinasjonen av penicillin og erytromycin enn i gruppene behandlet med penicillin alene . Ved hjelp av musen, peritonitis modell, in vivo-tid–drepe kurver viste at det var fiendskapet mellom erytromycin og penicillin for de undersøkte isolere., Motsetningen vist in vitro og in vivo mellom penicillin og erytromycin tyder på at β-lactam antibiotika og makrolider bør ikke gis sammen med mindre pneumokokk-infeksjon er utelukket.

Innledning

Det er en utfordring å velge riktig behandling for pasienter med lungebetennelse, som etiologi kan ikke forutsies basert på symptomer og kliniske funn alene, og en endelig mikrobiologisk diagnose har vanligvis ikke vært etablert før behandling har til start., Streptococcus pneumoniae er den hyppigst isolerte organismen i samfunnet-ervervet lungebetennelse, spesielt hos små barn og eldre pasienter, og infeksjonen fortsatt har en høy dødelighet.1 Men infeksjoner med Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae og Legionella spp. er også common2,3 og disse organismene er vanligvis ikke sensitive til de antimikrobielle agenter som vanligvis brukes for behandling av pneumococci. Derfor penicillin eller andre β-lactamer er ofte anbefales i kombinasjon med erytromycin for initial empirisk behandling av akutt lungebetennelse av ukjent etiologi.,4

Tidligere, in vitro og in vivo synergi mellom beta-lactam antibiotika, for eksempel penicillin, ampicillin, piperacillin og cefuroksim, har vist når det kombineres med gentamicin mot S. pneumoniae.5,6 Antagonisme in vitro har blitt demonstrert for kombinasjoner som ampicillin og chloramphenicol mot Haemophilus influenzae7 og mot gruppe B-streptokokker.,8 Klinisk viktig antagonisme har blitt rapportert mellom penicillin og tetracyklin mot pneumococci,9,10 penicillin og erytromycin mot En gruppe streptococci11 og ampicillin, streptomycin og kloramfenikol i akutt bakteriell meningitt.12 Teoretisk sett, empiriske initial behandling av lungebetennelse med en kombinasjon av en β-lactam agent og et makrolid kan også være inexpedient i tilfelle av pneumokokk-infeksjon, som bakteriostatisk makrolid kan motvirke den baktericid effekt av beta-lactam.,

I denne studien undersøkte vi den mulige interaksjonen mellom penicillin og erytromycin in vitro mot fire kliniske isolater av pneumococci med ulike susceptibilities å penicillin og erytromycin.6,13 Vi studerte vekselsvirkningene in vivo i musen peritonitis modell.6

Materialer og metoder

Bakterier, media og vekstvilkår for musen, peritonitis modell

Bakteriell suspensjoner å bli brukt som inocula for in vitro-og in vivo-tester ble tilberedt av ferske over natten kulturer på 5% blod agar plater laget av frossent lager kulturer., Den inokulat for musen eksperimenter ble utarbeidet umiddelbart før grader ved å utsette kolonier i sterilt Mueller–Hinton buljong (Statens Serum Institut, København, Danmark) og var justert til en optisk tetthet på 540 nm 0.5–1.0, noe som gir en konsentrasjon på ca. 108 cfu/mL, som beskrevet tidligere.13 For hvert eksperiment størrelsen av inokulat ble bestemt etter at 10-brett fortynninger i Mueller–Hinton, buljong, hvorav 20 µL var belagt på to 5% blod agar plater i flekker i duplikat, med påfølgende telling av kolonier etter inkubering over natten ved 35°C i luft., Mucin (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA), et enzym ekstrakt av svin magen, ble brukt som en adjuvans for grader av mus og var forberedt som en lager løsning 10% (w/v) i saltvann.13 Umiddelbart før grader, den mucin løsninger ble fortynnet 1:1 med pneumokokk suspensjoner, noe som gir en endelig mucin konsentrasjon av 5% (w/v).

stoffene som ble brukt var penicillin G (Leo Pharmaceutical Co., Ballerup, Danmark) og erytromycin (Sigma Chemical Co.). Penicillin G ble fortynnet i fosfat-bufret saltvann pH 6,5 ± 0.,1, og erytromycin ble fortynnet i 9 mL sterilt vann og 1 mL 96% alkohol; pH i erytromycin løsning ble justert til mellom 6.7 og 7.3.

Mikrofoner og MBCs

Mikrofoner ble bestemt av suppen macrodilution metode i glassrør. Alle testene ble gjort i duplikat og resultatene ble lest etter 20 timers inkubering ved 35°C. suppen macrodilution metode i glass rør ble utført med Mueller–Hinton buljong (Statens Serum Institut) som 5% saueblod var lagt; et inokulat av 106 cfu/mL ble brukt., Penicillin G ble fortynnet i to-brett trinnene i Mueller– Hinton buljong for å gi konsentrasjoner av 0.004–64 mg/L. Den laveste konsentrasjon av antibiotika på som det ikke var noen synlig vekst ble tatt som MIC. Vi brukte S. pneumoniae ATCC 49619 som en kontroll belastning for MIC-tester.

MBC ble bestemt ved subkultur av rør med noen synlig vekst etter MIC besluttsomhet. Fra hver tube, 100 µL ble dyrket på agar plater som inneholder penicillinase (Leo Pharmaceutical Co.) 1000 IU/plate og kolonier ble regnet etter 18-24 timers inkubering ved 35°C., MBC ble definert som den laveste konsentrasjon av penicillin som redusert inokulat av ≥99.9%. Alle analyser ble utført i duplikat.

Tid–drepe kurver

for Å studere mulige interaksjoner mellom penicillin og erytromycin, tid for å drepe eksperimenter ble utført med klinisk relevant penicillin og erytromycin konsentrasjoner av 10 og 1 mg/L, henholdsvis., Før tiden–drepe eksperimenter, isolere 86 (erytromycin resistente) ble dyrket på 5% blod agar plater som inneholder erytromycin 4 mg/L (induksjon av erytromycin resistens) og på plater uten erytromycin (nei induksjon av erytromycin resistens). Pneumococci (106 cfu/mL) ble inkubert i 20 mL av Mueller–Hinton buljong ved 35°C med risting. For å sikre eksponentielle veksten av bakterier, antibiotika ble først lagt etter 1 h av inkubasjon. Det ble tatt prøver før tilsetting av antibiotika og 1, 2, 3 og 5 timer senere., Tid–drepe kurvene var ikke forlenges ytterligere, siden autolysis begynte å skje etter 5-6 timer for alle isolater. Antall cfu/mL ble bestemt etter at passende fortynninger, og 100 µL ble fordelt på 5% blod agar plater. For ufortynnet prøver, agar plater som inneholder penicillinase (som ovenfor) ble brukt. Koloniene ble regnet etter 20 timers inkubering ved 35°C. Alle tid–drepe eksperimenter ble utført i duplikat. Variasjonen i kolonien teller på samme tid poeng for gjentatte eksperimenter var <0.5 log10 per mL., Motsetningen ble definert som en betydelig redusert drepe effekt (dvs. >0.5 log10 cfu/mL fra 1 til 5 h når du har lagt til narkotika) av kombinasjonen av penicillin og erytromycin som sammenlignet med penicillin alene.14

I tid–drepe eksperimenter, vi målte mulig pH endringer i kolber med pH-test strips (pH-område 4.5–10.0; uteksaminert i 0,5 pH-enheter; Sigma Chemical Co.).

Dyreforsøk (mus peritonitis modell)

Alle dyreforsøk ble godkjent av det danske nasjonale dyr etisk komité., Outbred kvinnelige ssc CF-1 mus (Statens Serum Institut) i alderen 8-12 uker, vekt 28-30 g ble brukt, i grupper på fem til 36 mus. Totalt er vi brukte 88 mus for å isolere 73, 89 mus for å isolere 75, 88 mus for å isolere 86 (uten induksjon), 94 mus for å isolere 86 (indusert med erytromycin som for tiden drepe studier) og 89 mus for å isolere 93. Musene ble holdt i bur med fem til syv mus per buret; de var tillatt gratis tilgang til mat og vann. Pneumokokk suspensjon (0,5 mL) ble inokulert intraperitoneally via en 25-gauge-sprøyten., Den inokulat inneholdt 106 cfu/mL med 5% (w/v) mucin i Mueller–Hinton buljong. Ved hjelp av slike inocula, det er ca. 100% dødelighet i ubehandlet mus, som etter 36-48 h etter grader. Antibiotika ble subkutant i nakke regionen i et volum på 0,25 mL per dose.13 følgende tidsplan ble brukt: erytromycin ble gitt 90 min etter bakteriell grader og i kombinasjon gruppe erytromycin ble gitt 90 min etter bakteriell grader og penicillin 60 min senere. Penicillin ble gitt alene 150 min etter bakteriell grader., Kontroll mus ble gitt sterilt saltvann 90 min etter bakteriell grader.

Doser av penicillin og erytromycin ble valgt i henhold til Bakken ligningen sigmoid dose–effekt-kurver, på en slik måte at penicillin alene kan forventes å resultere i c. 95% overlevelse, mens erytromycin alene var forventet å forhindre dødelighet på 10% av musene. Infiserte mus med å isolere 73 ble behandlet med penicillin 10 mg/ mus og/eller erytromycin 100 µg/mus. Infiserte mus med å isolere 75 ble behandlet med penicillin 2 mg/mus og/eller erytromycin 100 µg/mus., Infiserte mus med å isolere 86 (ikke indusert) ble behandlet med penicillin 150 µg/ mus og/eller erytromycin 100 µg/mus. Infiserte mus med å isolere 86 (vokst i nærvær av sub-hemmende konsentrasjon av erytromycin før grader) ble behandlet med penicillin 150 µg/mus og/eller erytromycin 100 µg/mus. Infiserte mus med å isolere 93 ble behandlet med penicillin 400 µg/mus og/eller erytromycin 100 µg/ mus.

blodprøver ble innhentet gjennom orbital kutt etter anaesthetizing musene med CO2., Mus ble drept og peritoneal vasker så ble utført ved å injisere 2 mL sterilt saltvann intraperitoneally, massere magen og åpne peritoneum å samle væske.15 Blod og peritoneal væske prøvene ble umiddelbart utvannet, og 0,1 mL var belagt på 5% blod agar plater.

In vivo-tid–drepe kurver ble bygget for en av de pneumococcus isolater (antall 93), som viste betydelig antagonisme in vivo. Pneumococci i bukhinnen og blod ble innhentet etter inoculating 36 mus intraperitoneally med 5,0 × 106 cfu/mL av bakterielle suspensjon., Ti minutter, 80 min, 140 min., 3 t og 5 h etter utfordring, grupper av tre kontroll mus (inokulert med sterilt saltvann) ble drept. På 140 minutter, 3 t og 5 h etter utfordring, grupper av tre mus behandlet med erytromycin 90 min etter challenge ble drept. På 3 timer og 5 h etter utfordring, grupper av tre mus behandlet enten med kombinasjonen av penicillin og erytromycin eller penicillin alene 150 min etter intraperitoneal infeksjon ble drept. Blod og peritoneal washings ble prøvetatt for kvantitative kultur av pneumococci.,

Fastsettelse av ED50 av penicillin for individuelle pneumococci

ED50, én dose gir beskyttelse til 50% av musene, for hver pneumococcus isolere ble bestemt ved behandling av grupper av fem mus med doble doser av antibiotika; overlevelse av musene ble observert for 7 dager. En gruppe på fem mus behandlet med 0.9% NaCl ble inkludert i hvert eksperiment som en kontroll for dødeligheten av infeksjonen. For hver isolere ED50 ble beregnet ved metoden av Reed & Muench16 og fra Bakken ligning (GraphPad Prism; GraphPad Programvare, Inc., San Diego, CA, USA). Vi gjorde ikke utføre eksperimenter for å beregne erytromycin ED50s siden dette har blitt gjort tidligere, for stammer med lignende Mikrofoner i vårt laboratorium.17 Vi valgte doser penicillin, som forventes å resultere i en estimert 95% overlevelse av mus og erytromycin doser, som forventes å resultere i anslagsvis 10% overlevelse av mus. For kombinasjon terapi, antibiotika ble gitt i separate injeksjoner.

Statistikk

Fisher ‘ s eksakte test for kategoriske data ble brukt, med en to-sidig 5% nivå av betydning.,

Resultater

Mikrofoner av penicillin og erytromycin og ED50s av penicillin for de fire pneumokokk-stammer er vist i Tabellen. Dødelig infeksjon ble oppnådd med tre av fire isolater. Men, ED50 av penicillin for å isolere 86 måtte være beregnet siden det bare var mulig å oppnå 90% dødelighet i ED50 fastsettelse eksperimenter.

resultatene av gang–drepe eksperimenter er vist i Figur 1., Ved denne metoden, alle isolater viste in vitro-antagonisme for kombinasjonen av penicillin og erytromycin (Figur 1a–c og e) fordi erytromycin nesten helt hemmet den baktericid effekt av penicillin. Imidlertid, når erytromycin resistens ble indusert ved økende erytromycin motstandsdyktig isolere (nummer 86) på blod agar plater som inneholder erytromycin 4 mg/L før den tid–drepe studie, erytromycin motsetningen ble nøytralisert (Figur 1d).

For alle isolater, in vitro-drapet effekt av penicillin og penicillin pluss erytromycin økt med tiden., Nedgangen i cfu sett i kontroll-kolber i noen eksperimenter var grunn til å autolysis, en vanlig observasjon med pneumococci. I alle eksperimenter, erytromycin alene viste en mindre drap effekt enn penicillin og kombinasjon. Ingen drap effekt ble observert under 5 timers inkubering i erytromycin motstandsdyktig mot belastning, enten inkubert med erytromycin eller ikke. Ingen endringer i pH ble observert i kanner som inneholder ett eller begge antibiotika: pH 7,5 etter 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timers inkubering.,

I musen peritonitis modell, fant vi ut at kombinert behandling med penicillin og erytromycin resulterte i motsetningen i mus utfordret med isolater 75 og 93 (Figur 2b og e). Det var betydelig høyere dødelighet i mus behandlet med erytromycin 60 min før penicillin enn i mus behandlet med penicillin alene (isolere 75: dødelighet 32/36 og 3/12, henholdsvis P < 0.05; isolere 93: dødelighet 24/36 og 3/12, henholdsvis P < 0.05) (Figur 2)., I de resterende to isolater, dødelighet hos mus gitt både antibiotika var lik som i mus gitt penicillin alene (Figur 2a og d). All kontroll mus døde når infisert intraperitoneally med pneumococci, bortsett fra infiserte mus med å isolere 86, der dødeligheten var på 80-90%. Selv når bakteriell inokulat av isolere 86 ble økt til 108 cfu/mL, det var ikke 100% dødelighet.

Den laveste dødelighet ble funnet i de grupper av mus behandlet med penicillin alene eller erytromycin penicillin pluss i kombinasjon etter bakteriell utfordring., Den høyeste dødelighet ble observert blant kontroll mus eller mus behandlet med erytromycin alene 90 min etter pneumokokk-infeksjon (Figur 2). For å isolere 86 fant vi at kombinert behandling gitt betydelig bedre beskyttelse mot pneumokokk infeksjon enn behandling med penicillin alene etter 150 min (32/35 mus i den tidligere gruppen overlevde sammenlignet med 6/12 i det siste; P = 0.009) eller erytromycin alene (32/35 og 16/36 overlevelse, henholdsvis; P = 0.005) (Figur 2c)., Når erytromycin resistens ble indusert før grader med isolere 86, den kombinerte behandlingen som gis betydelig bedre beskyttelse enn erytromycin alene (31/36 mus i den tidligere gruppen overlevde sammenlignet med 5/36 i det siste; P = 0.005).

in vivo tid–drepe kurver for å isolere 93 viste en 1-2 logg økning i veksten av bakterier i blodet 80 min etter utfordring sammenlignet med 10 min etter utfordring i kontroll-mus (Figur 3), mens antall pneumococci i peritoneal vasker på 80 min var den samme som 10 min etter grader., Antall pneumococci kultivert fra blod og peritoneal vasker på ulike tidspunkter i de ulike behandlingsgruppene var nesten parallelt, med 1-2 logg høyere cfu/mL i peritoneal vasker enn i blod. Dreper bakterier var mest effektive i penicillin-behandlet gruppe, med en nedgang i bakteriell vekst av 3 logger og 4 stokker i blod og peritoneal vasker, henholdsvis. Kombinasjonen terapi viste en lignende effekt på bakterievekst som når erytromycin ble gitt alene (antagonisme).,

Diskusjon

samspillet mellom erytromycin og penicillin mot pneumococci ble studert med fire isolater med forskjellige susceptibilities å penicillin eller erytromycin. In vitro-tid–drepe kurver for erytromycin-sensitive isolere (Figur 1a, b og e) viste klare motsetningene mellom de to stoffene, dvs. tilstedeværelse av erytromycin helt hemmet den baktericid aktivitet av penicillin og den resulterende kurven var lik den langsomme hemmende aktivitet av erytromycin alene., Hemming av effekten av penicillin (som er sure) kunne ha vært på grunn av økning i pH forårsaket av erytromycin (som er alkaliske stoff). Imidlertid pH-målinger i kolber med narkotika kombinasjon viste ingen endringer i pH. Den antagonistisk effekt ble sett også i uninduced erytromycin motstandsdyktig mot pneumokokk isolere (86), mens induksjon av uttrykk av erytromycin resistens genet forhindret den hemmende effekten av erythromycin og dens antagonistisk aktivitet på penicillin., Disse resultatene klart indikerer at det er hemmende aktivitet av makrolid på vekst eller celledeling av bakterier som er den viktigste årsaken til antagonisme mot penicillin, som kun kan handle på bakterier som er i vekstfasen og produsere en cellevegg.15 Dette bakteriostatisk aktivitet av erythromycin og dens hemmende effekt på penicillin var klart synlig i in vivo forsøk.,

for å vurdere mulig samspill mellom de to stoffene i vivo, vi valgte musen peritonitis modellen, som har vært nyttig for å vise samspillet mellom antibiotika,6 og som også gjør det mulig å studere stoffet action på bakterier ved å utføre in vivo-tid–drepe eksperimenter på organismer i bukhinnen og/eller blod.17 Doser av penicillin og erytromycin ble valgt i henhold til Bakken ligningen sigmoid dose–effekt-kurver, på en slik måte at penicillin alene kan forventes å resultere i c., 95% overlevelse, mens erytromycin alene ville bare være i stand til å forhindre dødelighet på 10% av musene. Med disse dosene, en effekt av erytromycin dose med ingen innflytelse av en påfølgende dose penicillin ville resultere i en dødeligheten bestemmes utelukkende av aktivitet av makrolid. Den antagonistisk aktivitet av de to stoffene ble senere bekreftet, etter tid–drepe kurver i vivo, for å være på grunn av den samme veksten-hemmende aktivitet av erytromycin som vist in vitro., Betydningen av induksjon av erytromycin resistens i erytromycin motstandsdyktig mot isolere (nummer 86) ble også demonstrert i vivo: induksjon med erytromycin betydelig redusert overlevelse på tross av erytromycin behandling sammenlignet med overlevelse følgende erytromycin behandling av uninduced pneumococci.

Med en erytromycin-utsatt isolere (nummer 73), det var ikke mulig å vise motsetningen in vivo med den metode som er brukt. Det kan være flere forklaringer på dette., Muligheten for at ikke alle pneumococci svare på en lignende måte til de to medikamenter som brukes virker usannsynlig, spesielt når aktiviteten var like påvist in vitro. Det er mer sannsynlig at situasjonen i vivo er forskjellig for de forskjellige stammer, f.eks. virulence av pneumoccci avhenger av en rekke faktorer som er vanskelig å standardisere, for eksempel type og størrelse av kapselen, andre virulence faktorer forbundet med membran eller giftstoffer, eller vekst behaviour in vivo, som er svært variabel for pneumococci., Det er sannsynlig at vi kunne ha vist antagonisme in vivo med å isolere 73 hvis vi hadde ‘titrated’ den inokulat og timing av de to stoffene i forhold til hverandre, men dette ville kreve en overdreven antall dyr., Clear-cut demonstrasjon av samspillet mellom to medisiner mot minst to pneumokokk stammer både in vitro og in vivo, som ble demonstrert ved økning i dødelighet, samt ved endringer i in vivo-tid–drepe kurver, er rikelig med bevis for effekt, og bør advare klinikere mot bruk av disse to stoffene sammen for å behandle pneumokokk infeksjoner.

Den kliniske betydningen av motsetningen mellom et bakteriedrepende stoff som penicillin eller ampicillin og en bakteriostatisk protein syntese-hemmer, f.eks., tetracyclin, erytromycin eller kloramfenikol, har blitt vist i flere studier.7-12,18 Antagonisme har blitt bekreftet i vivo i en eksperimentell studie med penicillin og kloramfenikol mot pneumokokk meningitt hos hunder.19 på tross av dette tidlig erfaring med slike stoff kombinasjoner, kombinasjonen av penicillin og erytromycin er anbefalt, selv i standard lærebøker som empirisk behandling i lungebetennelse av ukjent etiologi.4 stoffet kombinasjon er spesielt valgt ut til å omfatte pneumococci og Legionella spp.,, som er ansett for å være viktig og dødelig aetiological agenter i lungebetennelse. Det er vanskelig å vite om resultatene av denne studien er direkte knyttet til den kliniske situasjonen. I den kliniske situasjonen, sub-optimale doser for erytromycin vil vanligvis ikke bli brukt, men med hemmet virkningen av penicillin en kan ha til å stole på bakteriostatisk effekt av erytromycin, hvis pneumococcus er erytromycin utsatt. Det er ikke kjent om inducible effekten av erytromycin vist i denne studien tar også plass i pneumonic fokus på mennesker.,

I en konklusjon denne studien har vist at motsetningene mellom penicillin og erytromycin mot tre erytromycin-følsomme isolater av pneumococci in vitro. Denne motsetningen også skjedd med to av isolater i vivo i en enkel eksperimentell modell med mus. Når erytromycin resistens ble det ikke indusert, antagonisme ble også vist in vitro for erytromycin motstandsdyktig mot pneumokokk isolere, men induksjon med erytromycin før grader tilintetgjorde den antagonistisk effekt.

ekspert teknisk assistanse av Anja Borum og Jytte Markus Andersen er verdsatt., Foreløpige data presentert i endelig form i dette manuskriptet ble presentert på den Trettiende Interscience Konferanse om Antimikrobielle Midler og Kjemoterapi, Toronto, Ontario, Canada, 28. September–1. oktober 1, 1997 (plakat A-29).