1 Innledning
Integrert membran proteiner utgjør en stor andel av genomet til mange organismer—ca 25% av det humane genom—og utføre et variert utvalg av funksjoner, inkludert viktige trinn i kommunikasjonen av en celle med sine omgivelser., På grunn av deres biologiske og terapeutisk betydning (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), membranproteiner er fokus på grunnleggende og anvendt biofysiske forskning for å karakterisere tre-dimensjonale strukturer, dynamikk og interaksjon i native-lignende miljøer.,
Løsningen state-NMR spektroskopi har spilt en avgjørende rolle i membran protein biofysiske studier, som site-specific dynamic og interaksjon informasjon gitt av slike tilnærminger pent utfyller strukturelle data innhentet fra røntgen diffraksjon, cryo-EM, og beregningsorientert analyser (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, og med 2017; Opella & Marassi, 2017)., Grunnleggende for slike studier er flere 2D «fingeravtrykk spektra,» oftest 15N/1H HSQC (heteronuclear enkelt-quantum sammenheng) spektra (for ryggraden amide pluss Trp, Asn, og Gln sidechains) eller methyl 13C/1H HMQC (heteronuclear flere quantum sammenheng) spektra for sidechain metyl-grupper (Pellecchia et al., 2008). Disse methyl-anvist eksperimenter er spesielt fordelaktig for store, slow-tumbling membran protein/lipid komplekser; eksperimenter rettet mot andre sidechain og mainchain nettsteder har blitt brukt som godt., NMR eksperimenter kan gi informasjon om protein dynamics over mange tidsperioder, fra rask (ps–ns) sidechain bevegelser for å bremse conformational endringer (µs–ms) (Kasinath, Skarpe, & Tryllestav, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Tryllestaven, Moorman, & Harpole, 2013)., Mange av disse dynamics eksperimenter, ofte ved hjelp av sidechain metyl-grupper som prober, har blitt tilpasset og utviklet for store biomolekylære systemer, og kan brukes til membranproteiner (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
En spesiell fordel av løsning-stat NMR er at proteinene er undersøkt i en native-lignende løsning stat hvor de kan interconvert blant flere conformations., Imidlertid, membranproteiner må være solubilisert i en egnet membran mimetic som opprettholder opprinnelige struktur og dynamikk. Ulike alternativer inkluderer vaskemiddel micelles, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, og lipid blemmer, som hver har sine egne fordeler og ulemper (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Det er ofte nødvendig å teste ulike solubilization strategier for et gitt protein eksempel for stabilitet, signal intensitet og oppløsning, og lokale struktur/aktivitet., To viktige hensyn for alle membran mimetics er (1) en ensartet og liten partikkelstørrelse og (2) en høy grad av deuteration.
Høy-nivå deuteration, både innenfor membranen mimetic og protein i seg selv, er avgjørende for å redusere antall 1H signaler til stede i spektra (inkludert de fra lipider, som kan være intens) og til å forbedre avslapping egenskaper til den gjenværende NMR-aktiv spinn i utvalget., Mens deuteration er mulig for membran mimetic gjennom kjøp/syntese av deuterated forbindelser, skifte 1H med 2H i proteiner krever biosynthetic ble stiftet. For ryggraden eksperimenter i eukaryote uttrykk systemer, kan man label jevnt med 15N til å observere alle amides (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) eller gjennom tillegg av spesielt merket aminosyrer (Isogai et al., 2016)., For metyl-grupper, kan man enten gi riktig merket aminosyrer eller aminosyre forløpere (spesielt alfa-keto-syrer) til vekst i media for å få tilgang til ulike merking mønstre i sidechains av flere aminosyrer (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucin δ1 metyl-grupper spesielt nyttig gitt (1) overflod av Ile rester i integrert membranproteiner inkludert GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) den langt upfield 13C skift av isoleucin δ1 metyl-grupper , sette dem i en spesielt ubefolket område av 2D-13C/1H spektra, (3) mangel på behovet for å stereospecifically tilordne disse metyl-grupper, i motsetning til Val og Leu, og (4) tilstedeværelse av flere, fritt dreibar bånd mellom metyl-gruppen og protein ryggraden, noe som gir betydelige uavhengighet av dynamikk på disse sidene (Kasinath et al.,, 2013).
Mens mange av de tidligere nevnte merking strategier har blitt utviklet for E. coli, mange integrert membran protein kan bare uttrykkes på høye nivåer i eukaryote verter. Blant disse, methylotrophic gjær Pichia pastoris er en praktisk vert for heterologous uttrykk og isotopisk merking av eukaryote proteiner i membranen (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Fordeler av Pichia inkluderer hurtighet av genetisk manipulasjon, høy avkastning av rekombinant protein, eksistensen av posttranslational endring (PTM) og anstandsdame maskiner som er nødvendig for eukaryote membranproteiner, og evne til å vokse på definerte minimal media slik at for perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Uniform isotopisk merking i Pichia har blitt godt etablert (Morgan et al. I 2000; Pickford & O ‘ leary, 2004)., Vi har utvidet dette arbeidet ved å vise 13C, 1H-merking av isoleucin δ1-metyl-grupper i en perdeuterated bakgrunn ved å legge til merket α-ketobutyrate (~ 50% merking, ~ 90% deuteration) til svært deuterated vekst media (Clark et al., 2017, 2015). I kontrast, samtidig merking av leucine δ – og valin γ-metyl-grupper med α-ketoisovalerate er ineffektiv, men kan oppnås ved å legge til merket valin direkte til vekst media eller endre kultur betingelser (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia kan lett ta opp flere aminosyrer fra media, med en generell sammenheng mellom opptak effektivitet og energetiske kostnader til å syntetisere at aminosyre skriver de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Men etter opptak i celler, merket aminosyrer kan føres inn i metabolic pathways (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), fortynne signal om ønsket aminosyrer og kompliserende data analyse av isotopisk scrambling., Alternativt, auxotrophic stammer kan være utviklet for merking av en bestemt aminosyre, men forsiktighet må utvises for å bekrefte at off-target virkninger i andre metabolske veier ikke oppstår (Whittaker, 2007).
Her gir vi detaljerte protokoller for å generere slike U-2H (13C, 1H-Ile δ1 metyl)-merket integrert membranproteiner av overexpression i Pichia, ved hjelp av den menneskelige adenosin A2A reseptor som en modell system., Vi nærmere på hvordan slike prøver kan brukes i løsningen NMR studier, fra å anskaffe enkelt 13C/1H HMQC spektra, gjennom kjemisk skift oppdrag av nettstedet-anvist mutagenesis, til analyser av 1H–1H cross-avslapning målinger av rask sidechain dynamics.