Genetisk encodable bioluminescent-systemet fra sopp

• bioluminescence
• fungal luciferin biosyntese
• fungal luciferase

Bioluminescence er et naturlig fenomen av lys-utslipp som følge av oksidasjon av et substrat, luciferin, catalyzed av et enzym, luciferase. En rekke arter er bioluminescent i naturen (1); for mange av dem, evnen til å sende ut lys er et definerende trekk ved deres biologi (2⇓-4). Kunstig integrering av naturlige bioluminescent reaksjoner i levende systemer har også blitt et rapporteringsverktøy mye brukt i molekylær-og cellebiologi (5, 6)., Imidlertid, naturlig bioluminescent-systemer forbli dårlig preget på en biokjemisk nivå, begrense mer omfattende program. Bare 9 luciferins og 7 luciferase gen familier har blitt beskrevet (7, 8) på minst 40 bioluminescent-systemer antas å finnes i naturen (9). Beklagelig, bare en enkelt biokjemiske cascade fra en utbredt metabolitten til en luciferin har blitt beskrevet i sin helhet (10). Det er beskrevet vei er bakteriell og har begrenset anvendelse i eukaryotes (11)., Ingen av de eukaryote bioluminescent-systemer har blitt beskrevet i tilstrekkelig detalj til å være uttrykt i en annen organisme eller for å skape kunstig selvstendig bioluminescent organismer. Her beskriver vi funksjon og utvikling av viktige gener ansvarlig for bioluminescence av sopp Neonothopanus nambi og viser at uttrykk av fungal gener er tilstrekkelig til å konstruere selvstendig bioluminescent eukaryotes.

Omtrent 100 sopp-arter fra bestillingen Agaricales avgir lys benytte seg av de samme biokjemiske reaksjonen (12)., Selv om den økologiske rollen sin bioluminescence er ikke fullt ut forstått, det er bevis for at det kan bli brukt av sopp for å tiltrekke seg spore-distribusjon av insekter (13). Fungal bioluminescence var kjent for å bruke minst fire komponenter: molekylær oksygen; den luciferin, som nylig ble identifisert som 3-hydroxyhispidin, og to tidligere ubeskrevet viktige enzymer, en NAD(P)H-avhengige hydroksylase og en luciferase (15, 16).

for Å identifisere enzymer av fungal bioluminescent vei, vi fokuserte på isolering av luciferase genet. Ved å uttrykke N., nambi cDNA bibliotek i Pichia pastoris og sprøyting agar plater med syntetiske 3-hydroxyhispidin, vi har identifisert og sekvensert en selvlysende gjær koloni uttrykker luciferase genet (SI Bilag, Fiken. S1 og S13). N. nambi luciferase, nnLuz, er et 267-aa-protein (SI Bilag, Fig. S2) og har ingen beskrevet homologs eller uttalt sekvens likheten til et protein domener, noe som representerer en roman protein familie.

Gener som koder for enzymer som syntetisere sekundære metabolitter er ofte gruppert i fungal genomer (17)., Vi har en hypotese om at dette kan være tilfelle for enzymer av bioluminescent cascade, fordi det er antatt at cascade er bevart blant bioluminescent sopp (12). Dermed har vi sett etter gener som er relatert til luciferin biosyntese i nærheten av luciferase gen i N. nambi genom. I tillegg til N. nambi, vi også sekvensert genomet og transcriptomes av bioluminescent sopp Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, og Panellus stipticus og sammenlignet dem med offentlig tilgjengelig genom sekvenser av bioluminescent og nonbioluminescent sopp (18, 19)., Vi fant at luciferase er medlem av en bevart genet klyngen, som inkluderer minst to andre gener: h3h og hisps (Fig. 1 B og C og Datasett S1–S3).

h3h gen viste rekkefølge likhet med 3-hydroxybenzoate 6-monooxygenases, enzymer som katalysere oksidasjon av 3-hydroxybenzoate ved hjelp av NADH og molekylær oksygen. Denne reaksjonen er identisk med det som konverterer hispidin inn luciferin (Fig. 1A), og derfor er vi en hypotese om at h3h genet koder for hispidin-3-hydroksylase (H3H), enzymet som tilsvarer den forventede hydroksylase (15)., Vi klonet gen fra N. nambi og fant at P. pastoris kolonier å uttrykke både nnluz og nnh3h avgir lys når sprayet med luciferin forløper hispidin, i motsetning til kontroll kolonier å uttrykke nnluz alene (SI Bilag, Fiken. S14 og S17)—som bekrefter at nnH3H konverterer hispidin inn luciferin.

hisps genet (Fig. 1C) koder medlem av polyketide syntase familie, enzymer som produserer sekundære metabolitter i en rekke organismer over the tree of life (20)., Polyketide synthases vanligvis legge til malonyl moieties til den voksende karbon-kjeden, og dermed α-pyrone arten av hispidin foreslått at dens biosyntese kan utføres av en polyketide syntase fra caffeic syre av to sykluser med tillegg av malonyl-enheter etterfulgt av lactonization (Fig. 1A og SI Bilag, Fig. S3). Store modulære polyketide synthases krever posttranslational endringer for deres aktivitet (21), slik som overføring av en phosphopantetheinyl gruppe til en bevart serin rester av acyl carrier protein domene., For å teste om hisps genet kan produsere luciferin forløper i en heterologous systemet, har vi integrert hisps, nnluz, og nnh3h gener sammen med Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl transferase genet npgA i genomet av P. pastoris. Når dyrket i et medium som inneholder caffeic syre, gjær uttrykke alle fire gener lyset sett av en blotte øye (Fig. 3A), mens ingen vesentlige lys produksjonen ble observert i stammer mangler npgA eller hisps gener (SI Bilag, Fiken. S15 og S17)., Derfor, hisps catalyzes syntese av hispidin fra caffeic syre, som lukket kjede av reaksjoner (den «caffeic syre cycle») fra en vanlig mobil metabolitt med kjent biosyntese til en eukaryote luciferin.

I noen av bioluminescent arter av sopp, den genom klyngen har plass til en eller to ekstra gener (Fig. 1C): en tilhørighet til cytokrom P450-familien, og de andre som hører til familien av fumarylacetoacetate hydrolases., Sistnevnte (cph) sannsynlig blir en caffeylpyruvate hydrolase (Dataset S4) som er involvert i oxyluciferin resirkulering, i samsvar med caffeylpyruvate, den fungal oxyluciferin, blir hydrolysert til caffeate og pyruvate av en hydrolase til stede i fungal råolje ekstrakter (22).

Bevaring av genet klynge antyder at, i motsetning til andre grupper av bioluminescent organismer (23), bioluminescence utviklet seg i sopp bare én gang, med luz, h3h, og hisps gener fremvoksende gjennom gene duplikasjoner. Rekonstruert fylogenetisk trær for luz, h3h, og hisps gener (SI Bilag, Fiken., S4–S6) og arter treet for Agaricales (Fig. 2) avdekke utviklingen av bioluminescence cascade i sopp. Den primære luz enzym av fungal bioluminescence cascade dukket opp gjennom et gen duplisering ved foten av Agaricales, etterfulgt av duplisering av h3h og hisps et par millioner år senere. Det er interessant at mange arter i et stort clade koding hisps er nonbioluminescent, og hisps homologs i bioluminescent arter mangel to domener, ketoreductase og dehydratase domener (SI Bilag, Fig. S6)., Det er sannsynlig at tap av disse funksjonelle domener i den felles stamfar av bioluminescent arter favoriseres produksjon av α-pyrones av forfedrenes hisps, muligens for å gi det siste trinnet for fremveksten av bioluminescence.

genet klynge fortsatte å utvikle seg dynamisk etter oppkjøpet av bioluminescence. Minst seks uavhengige hel eller delvis genet tap hendelser av gener fra genom klynge førte til videregående tap av bioluminescence (Fig. 2). Cph genet ble satt inn i klyngen i nonmycenoid clade, muligens to ganger (Fig. 1)., Dette mosaikk mønster ligner evolusjonær historie av fluorescerende proteiner (24), en annen visuelt relevante protein familie med en uklar biologiske rolle, og kan tyde på at selektiv fordel gitt av bioluminescence i sopp er avhengig av en bestemt eller forbigående økologisk sammenheng.

Komplekse tilpasninger kan være en kilde til bioteknologisk relevante løsninger., I tillegg til å avsløre arten av grunnleggende fotokjemiske prosesser og protein evolusjon, luciferases er blant de primære typer reporter gener som er brukt i ulike undersøkelser rørledninger, metoder for diagnostikk og miljømessige programmer (5, 6, 25). For å avgjøre om en fungal bioluminescent vei kan gi reporter gener, vi preget nnLuz in vitro og testet sin evne til å produsere lys i heterologous systemer.

nnLuz protein består av 267 aminosyrer og har den molekylære massen av om 28.5 kDa (SI Bilag, Fig. S7)., Selv om dens mobil lokalisering in vivo er fortsatt ukjent, protein og har et anslått N-terminal er en av verdens helix, i samsvar med colocalization av luciferase aktivitet med uløselige celle fraksjoner i tidligere studier (22). Når det uttrykkes i S. pastoris, nnLuz var forbundet med den mikrosomale brøkdel (SI Bilag, Fig. S8) og slippes ut grønt lys med en maksimum på 520 nm og spectrum identisk med N. nambi mycel (Fig. 3A og SI Bilag, Fig. S9). Rekombinant nnLuz avgir lys optimalt på rundt pH 8.,0 moderate temperaturer, å miste sin aktivitet ved temperaturer over 30 °C (SI Bilag, Fig. S10).

for Å teste potensialet for nnluz som reporter gen i heterologous systemer, vi testet seg uttrykk i Escherichia coli, S. pastoris, tidlig Xenopus laevis embryo, og humane celler., Selv om luciferase akkumulert for det meste i inkludering organer når det uttrykkes i bakterier (SI Bilag, Fig. S7), alle testet celler og organismer uttrykke wild-type nnluz var tydelig bioluminescent når 3-hydroxyhispidin ble lagt til middels (Fig. 3 og SI Bilag, Fiken. S11 og S22). Vi har også sammenlignet nnLuz kvalitativt med luciferase fra firefly Photinus pyralis i hele kroppen imaging oppsett av tumor xenografts i mus. Vi s.c., implantert like mengder murin kolon carcinoma celler som uttrykker enten nnluz eller firefly luciferase under samme arrangør, vil injisert en blanding av firefly og sopp luciferins jeg.s., og fikk nesten identisk signaler fra implantater (Fig. 3C).

til Slutt, vi ønsket å teste om luciferin biosyntese kan oppnås i organismer mangler caffeic syre biosyntese. Innføring av ytterligere tre gener som koder for enzymer av caffeic syre biosyntese fra tyrosin, Rhodobacter capsulatus tyrosin ammoniakk lyase og to E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase komponenter (26), i genomet av P. pastoris belastning å bære npgA, hisps, h3h, og luz gener resulterte i en stamme som var selvstendig bioluminescent når vokst i en vanlig gjær medium (SI Bilag, Fiken. S12 og S16).

Derfor, under alle testede forhold, wild-type N. nambi luciferase er funksjonelle i heterologous systemer, posisjonere seg som en lovende reporter gen, og fungal luciferin kan bli syntetisert fra aromatiske aminosyrer i andre eukaryotes., I tillegg, sopp luciferin er en vannløselig og celle-permeable sammensatte, og dens light-emitting reaksjon er ikke avhengig av tilgjengelighet av ATP, noe som gjør fungal bioluminescent-systemet attraktivt for mange programmer i biomedical imaging. Videre, ulike luciferin analogs kan brukes til å forbedre lys utslipp og tune sine spektra, bedre lys penetrasjon i dyp vev imaging programmer (22).

I konklusjonen, presenterer vi enzymatisk kaskade som fører til lys-utslipp i sopp, som er en eukaryote bioluminescence system med kjent biosyntese av luciferin., Vi har vist at luciferin er syntetisert fra sin forløper hispidin av N. nambi H3H og at hispidin kan være direkte syntetiseres av hispidin syntase fra caffeic syre, en utbredt mobil metabolitt med effektiv biosyntese som ble oppnådd i ulike organismer, inkludert industrielt relevante gjær-stammer (26)., Bare to enzymatisk skritt fra mainstream metabolske veier, den fungal system har et høyt potensial for syntetisk biologi for å skape selvstendig glødende dyr og planter: forsøk på å utvikle slike organismer har så langt vært begrenset av dårlig ytelse i eukaryotes av bakterielle bioluminescent-systemet, det eneste systemet som luciferin biosyntese var kjent (27, 28).

Rekonstituering av fungal bioluminescent vei i eukaryote organismer kan aktivere programmer hvor vev eller organismer rapportere endringer i deres fysiologiske tilstand med autonome lys-utslipp., Det kan også presse frem utvikling av neste generasjon av organisk arkitektur (29), hvor genmodifiserte glødende planter vil bli integrert i bygninger og byens infrastruktur. Bortsett fra det, med sin spennende evolusjonær historie, en familie av luciferases, og generelle enkelhet, den fungal bioluminescent-systemet som presenteres her er en molekylær lekeplass holde mange muligheter for grunnleggende og anvendt forskning.,