Trekull-strippet føtalt kalveserum (se også Ref. 3)
1
Legg til 250 mg av kull og 25 mg Dextran T-70 til 100 ml av føtalt kalveserum (FCS).
2
Inkuber ved 56°C i 30 min.
3
Sentrifuger ved 3000-4000 rpm i 30 minutter ved romtemperatur.
4
Overfør supernatanten til frisk bøtter.
5
Gjenta forrige trinn.
6
Filtrer supernatanten gjennom en sil (type AP; Millipore, Bedford, MA) for å fjerne kull.
7
Filtrer løsningen gjennom en 0.,45-μ m porestørrelse filter (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
Lagre alikvoter ved -20°C.
Gelatin (10 × Lager)
1
Lag 1% (w/v) løsning av gelatin (G-2500; Sigma, St. Louis, MO -)
2
Autoklav i 20 min.
3
Oppbevar ved 4°C.
Gelatin-Belagt Retter/Flasker
1
Fortynn gelatin lager 10 ganger.
2
Pipetten denne løsningen på retter å dekke overflaten av parabolen helt (1,5 til 2 ml per 6-cm tallerken).
3
La retter for 2 time ved romtemperatur. For å sette fart på denne prosedyren kan de plasseres i inkubatoren ved 37°C i 1 time.,
4
Aspirer retter.
5
Pakk retter i aluminiumsfolie og lagre dem i romtemperatur eller ved 4°C.
HEBS buffer (10× lager)
1 2
Legg til dobbel-destillert vann for å 975 ml.
3
Juster pH til 7.05 og volumet til 1000 ml.
4
Autoklav løsningen, og oppbevar ved 4°C.
5
Før bruk, filtrert glukose løsning er lagt til buffer (se utarbeidelse av 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
Fortynn HEBS 10× lager fem ganger med sterilt H2O.
2
Legg til 0,2 ml av en filtrert glukoseoppløsning (1 g/ml) per 100 ml (endelig konsentrasjon, 10 mM).,
3
Juster pH til 7.05–7.08. Dette trinnet er avgjørende for dannelsen av Ca–DNA-komplekset.
4
Sterilisere løsning ved filtrering.
Fosfat-fosfatbufret saltløsning (PBS) uten kalsium og magnesium (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
Normal middels: Tilberedt med ikke-varme-inaktiverte FCS og medium med phenol red
Steroid-utarmet medium: Tilberedt med trekull-strippet FCS og medium uten phenol red. Dette mediet brukes bare når effekten av hormoner, som normalt finnes i serum, er å bli testet.,
Mengden av plasmider som brukes per transfection
Reporter plasmider konstruere, 6.5 µg
Uttrykk vektor, 1.0 µg
Uttrykk plasmider som en kontroll for transfection effektivitet, 0.5 µg
Når den totale mengden av DNA er mindre enn 8 til 10 µg, bærer-DNA (plasmider eller sild sperm DNA -) bør være lagt til for å få en god Ca–DNA utfellinger
Lyse buffer