… basert BactoScan FC, som bruker etidiumbromid farging av bakterier i melk, gir et resultat etter 8 min (5, 30). En flow – cytometrisk teknikk for måling av TBC i raw og ekstremt – temperatur melk med flekken SYTO BC har også blitt beskrevet tidligere (16). Imidlertid, disse teknikkene er enten svært spesifikke, oppdage en art, eller uspesifikke, oppdage alle bakterier., Mengde-cytometrisk teknikker for differensiering av bakterier i melk i større grupper, for eksempel gram-positive og gram-negative bakterier har ennå ikke blitt beskrevet. Gram-farging ble først beskrevet i 1883 av Christian Gram ‘ s kollega Carl Friedlander, dele bakterier inn i to grupper, og igjen i 1884 av Christian Gram (12, 14). Den konvensjonelle Gram-farging prosedyren omfatter flekker crystal violet og safranin. Varme-faste celler på et lysbilde er farget blå-fiolett med crystal violet, og etterpå, de er behandlet med etanol., Gram-negative bakterier er decolorized av etanol, mens de gram-positive bakterier er fortsatt farget med crystal violet. Heretter, safranin brukes til å counterstain gram – negative bakterier, noe som gir denne gruppen en rosa utseende. Mange alternative tilnærminger for å identifisere Gram reaksjon har vært rapportert. En metode der en koloni av bakterier er utsatt til 3% kaliumhydroksid er mye brukt. Den høye konsentrasjonen av kalium hydroksid lyserer gram-negative bakterier, avgi DNA fra celler, som kan bekreftes ved å trekke en tyktflytende string fra kolonien (15, 26)., Et alternativ Gram-farging teknikk med en fluorescein – conjugated lectin hvete germ agglutinin (WGA) for kombinert epifluorescence og et fase-kontrast mikroskop har blitt beskrevet (29). WGA binder seg til N -acetylglucosamine i peptidoglycan laget i celleveggen. Gram-negative bakterier har et lag av lipopolysaccharide som dekker cellevegg, og det er derfor de ikke er farget med WGA, mens de gram-positive bakterier er farget med WGA, som de ikke har en lipopolysaccharide lag., Disse resultatene viste en insensitivitet til alder, kultur, noe som innebar at denne flekken kan brukes direkte på prøver uten precultivation av prøven. En modi fi ed versjonen av WGA teknikken har blitt beskrevet for bakterier som er funnet i en nonfood miljø der bakterier immobilisert på en fi-filter, vasket, og deretter farget med WGA (11). Noen Gram-farging teknikker for fl mengde cytometry har også vært foreslått. En bruker fl uorescerende lipofile flekken rho – damine 123, som selektivt flekker gram-positive bakterier., Den lipopolysaccharide laget av gram-negative bakterier pre – ventiler oppføring av rhodamine 123 (1, 28). En annen lignende teknikk som kombinerer de to fl uorescerende DNA-bindende flekker, SYTO 13 og hexidium jodid (HI). SYTO 13 er en membran – permeable flekken, og HI er blokkert av lipopolysaccharide laget av gram-negative bakterier og dermed bare permeable til gram-positive bakterier og gram-negative bakterier med en de – stabilisert lipopolysaccharide layer (22). Imidlertid, på grunn av den skjøre natur lipopolysaccharide lag, vil disse teknikkene er ikke antas å være egnet for utmark prøver., Målet med den foreliggende arbeidet har vært å utvikle en Gram – farging teknikk basert på farging av bakterier med WGA og HEI og etterfulgt av fl mengde cytometrisk gjenkjenning. Teknikken ble evaluert på melk-forbundet bakterier (19, 20) i den stasjonære fasen, og etter 6, 12 og 48 timers inkubering i laboratoriet media. Videre er metoden ble testet på station – ary-fase kulturer som hadde blitt lagret i 24 t på Ϫ 18 ° C og for 14 dager ved 5 ° C. til Slutt, teknikken ble brukt til bulk tank melk tilsatt kjent bakterier., En teknikk for differensiering av gram-positive og gram-negative bakterier i bulk tank melk uten precultivation vil være det endelige programmet. Figur 1 viser effekten av KCl konsentrasjon på binding av WGA til gram-positive bakterier M. luteus og S. uberis , når bakterier er farget av WGA alene, unntatt HI. I histogrammer støy er sett til venstre, hvor hendelser med lav fl uorescence intensiteter har akkumulert (en terskel ble brukt til å skjære bort det meste av støy)., Når bakterier er farget suf fi ciently å skille dem fra støy, vil de vises som en topp helt skilles fra støy. Ved hjelp av 0 M KCl, ingen av de to bakterier ble farget nok til å skille dem fra støy. Ved hjelp av 1 M KCl, økt fl uorescence intensitet ble observert for både bakterier. M. luteus ble deretter separert fra støy, og S. uberis bare litt over slikket støy. Øke KCl konsentrasjon til 3 M ytterligere forbedret binding (høyere fl uorescence intensiteter) av WGA til disse bakteriene stammer, spesielt for M. luteus ., Mikroskopiske observasjoner viste at gram-positive bakterier ble farget av WGA, mens gram-negative bakterier ikke var farget av WGA. HEI farget både gram – positive og gram-negative bakterier. Figur 2 viser et eksempel på farging av en blanding (1:1) av gram-positive M. luteus og gram-negative E. coli med både WGA og HI. Som et resultat av farging, M. luteus dukket opp med et grønt underlag (WGA) og en rød cytoplasma (HI), mens E. coli bare dukket opp med en rød cytoplasma. Isometrisk plott av fl mengde cyto – metrisk analyser av kulturer av E. coli , M., luteus , og en blanding (1:1) av disse er vist i Fig. 3. Måling av E. coli alene (Fig. 3A), 100% av hendelsene var til stede i gram-negative regionen. For M. luteus alene (Fig. 3B), 99% av hendelsene var i gram-positive regionen og 1% av hendelsene angitt i gram-negative regionen. Når kulturer av E. coli og M. luteus ble blandet (Fig. 3C), 50% av hendelsene ble observert i hver region. Hver av de 12 bakterielle stammer som ble målt i duplikat etter 6,12, 24 og 48 timers inkubering. Fra hver måling, 100 hendelser som ble brukt ved beregningene. I Fig., 4 en samlet tomten er presentert som inneholder alle 800 hendelser for hver av de 12 bakterielle stammer testet under 48 timers inkubering (totalt 9,600 hendelser). Hver bakteriell belastning er presentert med en tydelig farge. En beregnet best linje for å skille gram-positive og gram-negative bakterier er vist. Samlet sett på linje sikret 97% av hendelsene til å bli riktig tolket. Prosentandelen av celler riktig tolket for den enkelte stammer ble beregnet, og er presentert i Tabell 1. For E. cloacae , E. coli , K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae , S., dys – galactiae , og S. uberis , nesten alle celler ( Ͼ 96%) var riktig tolket for alle inkubasjonstid. For B. cereus , P. fl uores – cens , og P. putida , Ͼ 93% av cellene ble tolket på riktig måte etter 12 og 24 timers inkubering, mens etter 6 og 48 timers inkubering bare 75 og 89% av cellene ble tolket på riktig måte. I Tabell 2 er resultatene fra fl mengde-flowcytometriske analyser av kulturer utsatt for ulike lagringsforhold er presentert., Når kulturer ble lagret ved 5 ° C i 14 dager, farging teknikken virket å være i fl uenced av alder, kultur, spesielt for gram-negative bakterier. Gjennomsnittlig prosentandel av riktig tolket cellene var 86%. For E. coli , M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , og S. uberis , de fleste cellene ( Ͼ 97%) var riktig tolket. For B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis , og S. aureus , 76 og 89% var riktig tolket, og for P. fl uorescens og P. putida , fi-tallene var 58 og 68%, henholdsvis., Frysing så ikke ut til å i fl sekvens flekken – ing teknikk. Etter lagring på Ϫ 18 ° C i 24 h, Ͼ 98% av cellene ble tolket på riktig måte for E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , og S. uberis . For B. cereus og P. fl uorescens , fi-tallene var 83 og 82%, henholdsvis. Figur 5 viser isometrisk plott av fl mengde-flowcytometriske analyser av S. aureus og E. coli lagt til bulk tank melk. For S. aureus (Fig. 5A), 98% av hendelsene var i gram-positive regionen og 2% av hendelsene angitt i gram-negative regionen., For E. coli (Fig. 5B), 96% av hendelsene var i gram – negative regionen og 4% av hendelsene inn den gram-positive regionen. Bidraget fra naturlige bakterier tilstede i melk utgjorde mindre enn 0,1%. I tillegg til en høy konsentrasjon av KCl til farging løsning forbedret evne til WGA til farging, gram-positive bakterier. En mulig forklaring er at gram-positive bakterier har teichoic syrer festet loddrett til sine cellevegger, som, for noen gram-positive bakterier, kan blokkere tilgang av WGA til cellevegg., Når konsentrasjonen av KCl er lav, strukturen av teichoic syrer er stiv, men ved å øke konsentrasjonen av KCl, strukturen vil være løsnet som kalium-ioner eliminere de negative ladninger på teichoic syrer, forårsaker struktur med å kollapse (8, 9). Sammensetning og struktur av teichoic syrer variere mellom gram-positive arter (24), noe som kan forklare hvorfor en økning i KCl konsentrasjon fra 1 til 3 M hadde en større effekt på M. luteus enn på S. uberis . I det foreliggende arbeidet, 3 M KCl ble brukt til å maksimere binding av WGA å gram-positive bakterier., Teknikker for eliminering av organiseringen av teichoic syrer har tidligere kun blitt rapportert for mikroskopisk programmer. Disse teknikker omfatter bruk av osmium tetroxide fi xation etterfulgt av aceton tillegg og fordampning (2) og varme fi xa – sjon av bakterier på en mikroskopisk dekselet (29). Imidlertid, disse behandlinger ikke kunne bli vurdert i denne studien, som dehydrering trinn er ikke egnet for fl mengde cytometry., Den Gram-farging teknikk viste pålitelige resultater for alle stammer, etter 6, 12, 24 og 48 timers inkubering, som nesten alle (97%) cellene ble riktig tolket. Disse resultatene con – form fi materiale av WGA Gram-farging metode rapportert …