… basierend BactoScan FC, das Ethidiumbromid verwendet, um Bakterien in Milch zu färben, liefert ein Ergebnis nach 8 min (5, 30). Zuvor wurde auch eine durchflusszytometrische Technik zur Messung von TBC in Rohmilch und Ultrahochtemperaturmilch mit dem Fleck SYTO BC beschrieben (16). Diese Techniken sind jedoch entweder sehr spezifisch und erkennen nur eine Spezies oder unspezifisch alle Bakterien., Durchflusszytometrische Techniken zur Differenzierung von Bakterien in Milch in größere Gruppen wie grampositive und gramnegative Bakterien wurden noch nicht beschrieben. Die Gram-Färbung wurde ursprünglich 1883 von Christian Grams Kollegen Carl Friedlander beschrieben, der Bakterien in zwei Gruppen aufteilte, und 1884 von Christian Gram (12, 14). Das herkömmliche Gram-Färbeverfahren umfasst die Flecken Crystal Violet und Safranin. Hitzebeständige Zellen auf einem Objektträger sind blauviolett mit Kristallviolett gefärbt und anschließend mit Ethanol behandelt., Gramnegative Bakterien werden durch Ethanol entfärbt, während grampositive Bakterien mit Kristallviolett gefärbt bleiben. Im Folgenden wird Safranin verwendet, um gramnegativen Bakterien entgegenzuwirken und dieser Gruppe ein rosa Aussehen zu verleihen. Zahlreiche alternative Ansätze zur Identifizierung der Gram-Reaktion wurden berichtet. Eine Methode, bei der eine Bakterienkolonie 3% Kaliumhydroxid ausgesetzt ist, ist weit verbreitet. Die hohe Konzentration von Kaliumhydroxid lysiert gramnegative Bakterien und setzt DNA aus den Zellen frei, was durch Ziehen einer viskosen Schnur aus der Kolonie bestätigt werden kann (15, 26)., Eine alternative Gram-Färbetechnik mit einem Fluorescein-konjugierten Lectin-Weizenkeim-Agglutinin (WGA) zur kombinierten Epifluoreszenz und einem Phasenkontrastmikroskop wurde beschrieben (29). WGA bindet an N -acetylglucosamin in der Peptidoglycan-Schicht der Zellwand. Gramnegative Bakterien haben eine Schicht Lipopolysaccharid, die die Zellwand bedeckt, und deshalb sind sie nicht mit WGA gefärbt, während grampositive Bakterien mit WGA gefärbt sind, da sie keine Lipopolysaccharidschicht haben., Diese Ergebnisse zeigten eine Unempfindlichkeit gegenüber dem Alter der Kultur, was implizierte, dass dieser Fleck direkt auf Proben ohne Präkultivierung der Probe verwendet werden konnte. Eine Modi fi ed-Version der WGA-Technik wurde für Bakterien beschrieben, die in einer Nonfood-Umgebung gefunden wurden, in der die Bakterien auf einem fi-Filter immobilisiert, gewaschen und dann mit WGA gefärbt werden (11). Einige Gram-Färbetechniken für die fl ow-Zytometrie wurden ebenfalls vorgeschlagen. Man verwendet den fluoreszierenden lipophilen Fleck Rho-Damin 123, der selektiv grampositive Bakterien färbt., Die Lipopolysaccharidschicht gramnegativer Bakterien verhindert den Eintritt von Rhodamin 123 (1, 28). Eine andere ähnliche Technik kombiniert die beiden fluoreszierenden DNA-Bindungsflecken SYTO 13 und Hexidiumiodid (HI). SYTO 13 ist ein membrandurchlässiger Fleck, der durch die Lipopolysaccharidschicht gramnegativer Bakterien blockiert wird und somit nur für grampositive Bakterien und gramnegative Bakterien mit einer desstabilisierten Lipopolysaccharidschicht durchlässig ist (22). Aufgrund der Zerbrechlichkeit der Lipopolysaccharidschicht wird jedoch angenommen, dass diese Techniken nicht für unkultivierte Proben geeignet sind., Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Gram – Färbetechnik zu entwickeln, die auf der Färbung von Bakterien mit WGA und HI und anschließendem fl ow-zytometrischem Nachweis basiert. Die Technik wurde an milchassoziierten Bakterien (19, 20) in der sta-tionären Phase und nach 6, 12 und 48 h Inkubation in laborischen Medien ausgewertet. Des Weiteren wurde das Verfahren an Station – ary-Phasenkulturen getestet, die 24 h bei Ϫ 18 ° C und 14 Tage bei 5 ° C gelagert worden waren.Abschließend wurde die Technik auf mit bekannten Bakterien gespickte Schüttgutmilch angewendet., Eine Technik zur Differenzierung von grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bulk-Tankmilch ohne Präkultivierung wird die ultimative Lösung sein. Abbildung 1 zeigt die Wirkung der KCl-Konzentration auf die Bindung von WGA an die grampositiven Bakterien M. luteus und S. uberis , wenn die Bakterien allein durch WGA gefärbt werden, mit Ausnahme von HI. In den Histogrammen ist das Rauschen nach links zu sehen, wo sich Ereignisse mit niedrigen Fluoreszenzintensitäten angesammelt haben (ein dreschiger wurde verwendet, um den größten Teil des Rauschens abzuschneiden)., Wenn Bakterien befleckt werden, um sie von Lärm zu unterscheiden, erscheinen sie als Spitze, die vollständig vom Lärm getrennt ist. Mit 0 M KCl war keines der beiden Bakterien fleckig genug, um sie vom Lärm zu trennen. Bei Verwendung von 1 M KCl wurde für beide Bakterien eine erhöhte Fluor-Zenzintensität beobachtet. M. luteus wurde dann vom Lärm getrennt, und S. uberis übertönte den Lärm nur geringfügig. Eine Erhöhung der KCl-Konzentration auf 3 M verbesserte die Bindung (höhere Fluoreszenzintensitäten) von WGA an diese Bakterienstämme, insbesondere für M. luteus, weiter ., Mikroskopische Beobachtungen zeigten, dass grampositive Bakterien durch WGA gefärbt wurden, während gramnegative Bacte-ria nicht durch WGA gefärbt wurden. HALLO, sowohl die grampositiven als auch die gramnegativen Bakterien. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die Färbung einer Mischung (1:1) des grampositiven M. luteus und des gramnegativen E. coli mit WGA und HI. Infolge der Färbung erschien M. luteus mit einer grünen Oberfläche (WGA) und einem roten Zytoplasma (HI), während E. coli nur mit einem roten Zytoplasma auftrat. Isometrische Plots von fl ow zytometrischen Analysen von Kulturen von E. coli, M., luteus und eine Mischung (1:1) davon sind in Abb. 3. Messung von E. coli allein (Abb. 3A) waren 100% der Ereignisse im gramnegativen Bereich vorhanden. Für M. luteus allein (Abb. 3B) befanden sich 99% der Ereignisse im grampositiven Bereich und 1% der Ereignisse trat in den gramnegativen Bereich ein. Wenn Kulturen von E. coli und M. luteus gemischt wurden (Abb. 3C) wurden 50% der Ereignisse in jeder Region beobachtet. Jeder der 12 Bakterienstämme wurde nach 6,12, 24 und 48 h Inkubation doppelt gemessen. Von jeder Messung wurden 100 Ereignisse für Berechnungen verwendet. In Abb., 4 es wird ein zusammengesetztes Diagramm präsentiert, das alle 800 Ereignisse für jeden der 12 Bakterienstämme enthält, die während 48 Inkubationsstunden getestet wurden (insgesamt 9.600 Ereignisse). Jeder Bakterienstamm hat eine eigene Farbe. Eine berechnete beste Linie zum Trennen grampositiver und gramnegativer Bakterien wird gezeigt. Insgesamt sorgte die Linie dafür, dass 97% der Ereignisse korrekt interpretiert wurden. Die für die einzelnen Stämme korrekt interpretierten Zellprozentsätze wurden berechnet und sind in Tabelle 1 dargestellt. Für E. cloacae , E. coli , K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae , S., dys-galactiae und S. uberis , fast alle Zellen ( Ͼ 96%) wurden für jede Inkubationszeit korrekt interpretiert. Für B. cereus , P. flycores – cens und P. putida wurden Ͼ 93% der Zellen nach 12 und 24 h Inkubation korrekt interpretiert , während nach 6 und 48 h Inkubation nur 75 bis 89% der Zellen korrekt interpretiert wurden. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse von fl ow-zytometrischen Analysen von Cul – turen dargestellt, die unterschiedlichen Lagerbedingungen ausgesetzt sind., Wenn die Kulturen 14 Tage bei 5 ° C gelagert wurden, schien die Färbetechnik durch das Alter der Kultur insbesondere für gramnegative Bakterien beeinträchtigt zu sein. Der durchschnittliche Prozentsatz korrekt interpretierter Zellen betrug 86%. Für E. coli , M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , S. uberis , die meisten Zellen ( Ͼ 97%) richtig interpretiert wurden. Für B. cereus, E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis und S. aureus wurden 76 bis 89% korrekt interpretiert , und für P. fl uorescens und P. putida waren die Fi-Werte 58 bzw., Das Einfrieren schien die Färbetechnik nicht zu stören. Nach Lagerung bei Ϫ 18 ° C für 24 h, Ͼ 98% der Zellen waren richtig interpretiert für E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , S. uberis . Bei B. cereus und P. fl uorescens waren es 83 bzw. 82%. Abbildung 5 zeigt die isometrischen Plots von fl ow-zytometrischen Anal-ysen von S. aureus und E. coli, die der Milch in großen Tanks zugesetzt werden. Für S. aureus (Abb. 5A) befanden sich 98% der Ereignisse im grampositiven Bereich und 2% der Ereignisse traten in den gramnegativen Bereich ein., Für E. coli (Abb. 5B), 96% der Ereignisse befanden sich im gramnegativen Bereich und 4% der Ereignisse traten in den grampositiven Bereich ein. Der Beitrag der in der Milch vorhandenen natürlichen Bakterien betrug weniger als 0,1%. Die Zugabe einer hohen Konzentration von KCl zu der Färbelösung verbesserte die Fähigkeit von WGA, grampositive Bakterien zu färben. Eine mögliche Erklärung ist, dass grampositive Bakterien Teichoesäuren senkrecht an ihre Zellwände binden, was bei einigen grampositiven Bakterien den Zugang von WGA zur Zellwand blockieren kann., Wenn die Konzentration von KCl niedrig ist, ist die Struktur der Teichoesäuren starr, aber durch Erhöhen der Konzentration von KCl wird die Struktur gelockert, da die Kaliumionen die negativen Ladungen auf die Teichoesäuren beseitigen, wodurch die Struktur zusammenbricht (8, 9). Die Zusammensetzung und Struktur von Teichoesäuren variiert zwischen grampositiven Spe-zies (24), was erklären kann, warum ein Anstieg der KCl – Konzen-tration von 1 auf 3 M eine größere Wirkung auf M. luteus hatte als auf S. uberis . In der vorliegenden Arbeit wurde 3 M KCl verwendet, um die Bindung von WGA an grampositive Bakterien zu maximieren., Techniken zur Eliminierung der Organisation der Teichoesäuren wurden vorab nur für mikroskopische Anwendungen berichtet. Diese Techniken umfassen die Verwendung von Osmiumtetroxid fi xation fol-lowed durch Acetonzugabe und-verdampfung (2) und Wärme fi xa – tion von Bakterien auf einem mikroskopischen Objektträger (29). Diese Behandlungen konnten jedoch in der vorliegenden Studie nicht in Betracht gezogen werden, da ein Dehydrationsschritt für die fl ow-Zytometrie nicht geeignet ist., Die Gram-Färbetechnik zeigte zuverlässige Ergebnisse für alle Stämme nach 6, 12, 24 und 48 h Inkubation, für die fast alle (97%) Zellen korrekt interpretiert wurden. Diese Ergebnisse entsprechen den Ergebnissen der neuportierten WGA-Gramfärbemethode …