1 Einführung
Integrale Membranproteine machen einen großen Teil der Genome vieler Organismen aus—etwa 25% des menschlichen Genoms—und erfüllen eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Schlüsselschritte in der Kommunikation einer Zelle mit ihrer Umgebung., Aufgrund ihrer biologischen und therapeutischen Bedeutung (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009) stehen Membranproteine im Mittelpunkt der fundamentalen und angewandten biophysikalischen Forschung zur Charakterisierung dreidimensionaler Strukturen, Dynamiken und Wechselwirkungen in nativen Umgebungen.,
Die NMR-Spektroskopie im Lösungszustand hat in biophysikalischen Untersuchungen an Membranproteinen eine entscheidende Rolle gespielt, da die ortsspezifischen dynamischen und Interaktionsinformationen, die durch solche Ansätze bereitgestellt werden, Strukturdaten aus Röntgenbeugung, Kryo-EM und Computeranalysen gut ergänzen (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Grundlegend für solche Studien sind mehrere 2D – „Fingerabdruckspektren“, meistens 15N/1H HSQC-Spektren (heteronukleäre Einzelquantenkohärenz) (für Backbone-Amid plus Trp -, Asn-und Gln-Sidechains) oder Methyl-13C/1H HMQC-Spektren (heteronukleare Multiple-Quantenkohärenz) für Sidechain-Methylgruppen (Pellecchia et al., 2008). Diese methylgerichteten Experimente sind besonders vorteilhaft für große, langsam taumelnde Membranprotein-/Lipidkomplexe; Experimente, die auf andere Sidechain-und Mainchain-Stellen gerichtet sind, wurden ebenfalls erfolgreich angewendet., NMR-Experimente liefern können Informationen zu protein-Dynamik über viele Zeitskalen, von schnell (ps–ns) sidechain-Bewegungen zu verlangsamen konformationsänderungen (µs–ms) (Kasinath, Scharf, & Zauberstab, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Stab, Moorman, & Harpole, 2013)., Viele dieser Dynamikexperimente, bei denen häufig Sidechain-Methylgruppen als Sonden verwendet werden, wurden für große biomolekulare Systeme angepasst und entwickelt und können für Membranproteine verwendet werden (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
Ein besonderer Vorteil von NMR im Lösungszustand besteht darin, dass Proteine in einem nativen Lösungszustand untersucht werden, in dem sie zwischen mehreren Konformationen interagieren können., Membranproteine müssen jedoch in einem geeigneten Membranimetikum solubilisiert werden, das die native Struktur und Dynamik beibehält. Verschiedene Optionen umfassen Waschmittelmizellen, Amphipole, Bicellen, Nanodiscs, SMALPs und Lipidbläschen mit jeweils eigenen Vorteilen und Nachteilen (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Es ist oft notwendig, verschiedene Lösungs-Strategien für eine gegebene Proteinprobe auf Stabilität, Signalintensität und Auflösung sowie native Struktur/Aktivität zu testen., Zwei wichtige Überlegungen für alle Membran-Mimetika sind (1) eine gleichmäßige und geringe Partikelgröße und (2) ein hoher Deuterationsgrad.
Eine hochgradige Deuteration sowohl innerhalb des Membranimetikums als auch innerhalb des Proteins selbst ist entscheidend, um die Anzahl der 1H-Signale in Spektren (einschließlich derjenigen von Lipiden, die intensiv sein können) zu reduzieren und die Entspannungseigenschaften der verbleibenden NMR-aktiven Spins in der Probe zu verbessern., Während Deuteration für die Membranimetik durch den Kauf/die Synthese von deuterierten Verbindungen möglich ist, erfordert das Ersetzen von 1H durch 2H in Proteinen einen biosynthetischen Einbau. Für Backbone-Experimente in eukaryotischen Expressionssystemen kann man einheitlich mit 15N beschriften, um alle Amide zu beobachten (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) oder durch Zugabe von speziell markierten Aminosäuren (Isogai et al., 2016)., Für Methylgruppen kann man entweder entsprechend markierte Aminosäuren oder Aminosäurevorläufer (insbesondere Alpha-Ketosäuren) für Wachstumsmedien bereitstellen, um auf verschiedene Kennzeichnungsmuster in den Sidechains mehrerer Aminosäuren zuzugreifen (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind Isoleucin δ1 Methylgruppen besonders nützlich gegeben (1) die Fülle von Ile-Rückständen in integralen Membranproteinen einschließlich GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) die weit oben liegende 13C-Verschiebung von Isoleucin δ1 Methylgruppen , die sie in einen besonders nicht überfüllten Bereich von 2D 13C/1H-Spektren bringt, (3) die fehlende Notwendigkeit, diese Methylgruppen im Gegensatz zu Val und Leu stereospezifisch zuzuordnen, und (4) die Anwesenheit von von mehreren, frei drehbaren Bindungen zwischen der Methylgruppe und dem Proteinrückgrat, die an diesen Stellen eine erhebliche Unabhängigkeit der Dynamik gewährleisten (Kasinath et al.,, 2013).
Während viele der vorgenannten Etikettierungsstrategien für E. coli gut entwickelt wurden, können viele integrale Membranproteine nur in hohen Konzentrationen in eukaryotischen Wirten exprimiert werden. Unter diesen ist die methylotrophe Hefe Pichia pastoris ein geeigneter Wirt für die heterologe Expression und Isotopenmarkierung von eukaryotischen Membranproteinen (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Zu den Vorteilen von Pichia gehören die Schnelligkeit der genetischen Manipulation, hohe Erträge an rekombinantem Protein, das Vorhandensein von posttranslationalen Modifikationen (PTM) und Chaperon-Maschinen, die für eukaryotische Membranproteine notwendig sind, und die Fähigkeit, auf definierten minimalen Medien zu wachsen, die eine Perdeuteration ermöglichen (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Einheitliche Isotopenmarkierung in Pichia ist gut etabliert (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‚ Leary, 2004)., Wir haben diese Arbeit erweitert, indem wir die 13C, 1H-Kennzeichnung von Isoleucin δ1-Methylgruppen in einem eleutrierten Hintergrund demonstriert haben, indem wir markiertes α-Ketobutyrat (~ 50% Kennzeichnung, ~ 90% Deuteration) zu hoch deuterierten Wachstumsmedien hinzugefügt haben (Clark et al., 2017, 2015). Im Gegensatz dazu ist die gleichzeitige Markierung von Leucin δ – und Valin γ-Methylgruppen mit α-Ketoisovalerat ineffizient, kann jedoch erreicht werden, indem markiertes Valin direkt zu den Wachstumsmedien hinzugefügt oder Kulturbedingungen modifiziert werden (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia kann leicht zusätzliche Aminosäuren aus Medien aufnehmen, mit einer allgemeinen Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und den energetischen Kosten für die Synthese dieses Aminosäuretyps de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Nach der Aufnahme in Zellen können markierte Aminosäuren jedoch in Stoffwechselwege eingespeist werden (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), das Signal der gewünschten Aminosäuren verdünnen und die Datenanalyse durch Isotopencrambling erschweren., Alternativ können auxotrophe Stämme zur Kennzeichnung einer bestimmten Aminosäure entwickelt werden; Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass keine Off-Target-Effekte in anderen Stoffwechselwegen auftreten (Whittaker, 2007).
Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, die benötigt werden, um solche U-2H (13C, 1H-Ile δ1 methyl)-markierten integralen Membranproteine durch Überexpression in Pichia unter Verwendung des humanen Adenosin-A2A-Rezeptors als Modellsystem zu erzeugen., Wir beschreiben weiter, wie solche Proben in Lösungs-NMR-Studien verwendet werden können, von der Erfassung einfacher 13C/1H HMQC-Spektren über chemische Verschiebungszuordnungen durch standortgerichtete Mutagenese bis hin zu Analysen von 1H–1H-Kreuzrelaxationsmessungen der schnellen Sidechain-Dynamik.