Genetisch kodierbares Biolumineszenzsystem aus Pilzen

• Biolumineszenz
• Pilz-Luciferin-Biosynthese
• Pilz-Luciferase

Biolumineszenz ist ein natürliches Phänomen der Lichtemission, das durch Oxidation eines Substrats, Luciferin, durch ein Enzym, Luciferase, katalysiert wird. Eine Vielzahl von Arten sind Biolumineszenz in der Natur (1); Für viele von ihnen ist die Fähigkeit, Licht zu emittieren, ein bestimmendes Merkmal ihrer Biologie (2⇓-4). Die künstliche Integration natürlicher Biolumineszenzreaktionen in lebende Systeme ist auch zu einem in der Molekular-und Zellbiologie weit verbreiteten Berichtsinstrument geworden (5, 6)., Natürliche Biolumineszenzsysteme bleiben jedoch auf biochemischer Ebene schlecht charakterisiert und begrenzen eine breitere Anwendung. Es wurden nur 9 Luciferine und 7 Luciferase-Genfamilien beschrieben (7, 8) von mindestens 40 Biolumineszenzsystemen, von denen angenommen wird, dass sie in der Natur existieren (9). Bedauerlicherweise wurde nur eine einzige biochemische Kaskade beschrieben, die von einem weit verbreiteten Metaboliten zu einem Luciferin ausgeht (10). Der beschriebene Weg ist bakteriell und hat eine begrenzte Anwendung in Eukaryoten (11)., Keines der eukaryotischen Biolumineszenzsysteme wurde ausreichend detailliert beschrieben, um in einem anderen Organismus exprimiert zu werden oder künstliche autonom Biolumineszenzorganismen zu erzeugen. Hier beschreiben wir die Funktion und Evolution der Schlüsselgene, die für die Biolumineszenz des Pilzes Neonothopanus nambi verantwortlich sind und zeigen, dass die Expression von Pilzgenen ausreicht, um autonom biolumineszierende Eukaryoten zu entwickeln.

Ungefähr 100 Pilzarten aus der Ordnung Agaricales emittieren Licht unter Verwendung derselben biochemischen Reaktion (12)., Obwohl die ökologische Rolle ihrer Biolumineszenz nicht vollständig verstanden ist, gibt es Hinweise darauf, dass sie von Pilzen verwendet werden könnte, um sporenverteilende Insekten anzulocken (13). Es war bekannt, dass die Pilzbiolumineszenz mindestens vier Komponenten verwendet: molekularen Sauerstoff; das Luciferin, das kürzlich als 3-Hydroxyhispidin identifiziert wurde ; und zwei zuvor nicht beschriebene Schlüsselenzyme, eine NAD (P)H-abhängige Hydroxylase und eine Luciferase (15, 16).

Um Enzyme des Pilz-Biolumineszenzwegs zu identifizieren, konzentrierten wir uns zunächst auf die Isolierung des Luciferase-Gens. Durch den Ausdruck der N., nambi cDNA-Bibliothek in Pichia pastoris und Besprühen von Agarplatten mit synthetischem 3-Hydroxyhispidin identifizierten und sequenzierten wir eine lumineszierende Hefekolonie, die das Luciferase-Gen exprimierte(SI Anhang, Abb. S1 und S13). Die N. nambi luciferase, nnLuz, ist ein 267-aa-protein (SI-Anhang, Abb. S2) und weist keine beschriebenen Homologen oder ausgeprägte Sequenzähnlichkeit mit konservierten Proteindomänen auf, die eine neuartige Proteinfamilie darstellen.

Gene, die für Enzyme kodieren, die sekundäre Metaboliten synthetisieren, werden häufig in Pilzgenomen gruppiert (17)., Wir stellten die Hypothese auf, dass dies bei Enzymen der Biolumineszenzkaskade der Fall sein könnte, da angenommen wird, dass die Kaskade unter den Biolumineszenzpilzen konserviert ist (12). Wir suchten daher nach Genen, die mit der Luciferin-Biosynthese in der Nähe des Luciferase-Gens im N. nambi-Genom zusammenhängen. Neben N. nambi sequenzierten wir auch Genome und Transkriptome von Biolumineszenzpilzen Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor und Panellus stipticus und verglichen sie mit öffentlich zugänglichen Genomsequenzen von Biolumineszenz-und Nichtbiolumineszenzpilzen (18, 19)., Wir fanden heraus, dass die Luciferase ein Mitglied eines konservierten Genclusters ist, zu dem mindestens zwei weitere Gene gehören: h3h und hisps (Abb. 1 B und C und Datensätze S1-S3).

Das h3h-Gen zeigte Sequenzähnlichkeit mit 3-Hydroxybenzoat-6-Monooxygenasen, Enzymen, die die Oxidation von 3-Hydroxybenzoat unter Verwendung von NADH und molekularem Sauerstoff katalysieren. Diese Reaktion ist identisch mit der, die Hispidin in Luciferin umwandelt (Abb. 1A); So stellten wir die Hypothese auf, dass das h3h-Gen für Hispidin-3-hydroxylase (H3H) kodiert, das Enzym, das der vorhergesagten Hydroxylase entspricht (15)., Wir haben das Gen von N. nambi geklont und festgestellt, dass P. pastoris-Kolonien, die sowohl nnluz als auch nnh3h exprimieren, Licht emittieren, wenn sie mit Luciferin-Vorläufer Hispidin besprüht werden, im Gegensatz zu Kontrollkolonien, die nnluz allein exprimieren (SI Anhang, Abb. S14 und S17) – bestätigt, dass nnH3H Hispidin in Luciferin umwandelt.

Das hisps-Gen (Abb. 1C) kodiert ein Mitglied der Polyketidsynthase-Familie, Enzyme, die sekundäre Metaboliten in einer Vielzahl von Organismen über den Baum des Lebens produzieren (20)., Polyketidsynthasen fügen der wachsenden Kohlenstoffkette typischerweise Malonylmoleküle hinzu; Daher schlug die α-Pyron-Natur von Hispidin vor, dass seine Biosynthese durch eine Polyketidsynthase aus Kaffeesäure durch zwei Zyklen der Zugabe von Malonyleinheiten gefolgt von Laktonisierung durchgeführt werden könnte (Abb. 1A und SI-Anhang, Abb. S3). Große modulare Polyketidsynthasen erfordern posttranslationale Modifikationen für ihre Aktivität (21), wie die Übertragung einer Phosphopantetheinylgruppe auf einen konservierten Serinrest der Acylträgerproteindomäne., Um zu testen, ob hisps-Gen Luciferin-Vorläufer in einem heterologen System produzieren kann, haben wir hisps -, nnluz-und nnh3h-Gene zusammen mit dem Aspergillus nidulans 4′ – Phosphopantetheinyltransferase-Gen npgA in das Genom von P. pastoris integriert. Bei Kultivierung in einem Medium, das Kaffeesäure enthält, emittierten Hefen, die alle vier Gene exprimierten, mit bloßem Auge gesehenes Licht (Abb. 3A), während bei Stämmen ohne npgA-oder Hisps-Gene keine signifikante Lichtproduktion beobachtet wurde(SI Anhang, Abb. S15 und S17)., Daher katalysiert hisps die Synthese von Hispidin aus Kaffeesäure und schließt die Reaktionskette (den „Kaffeesäurezyklus“) von einem gemeinsamen zellulären Metaboliten mit bekannter Biosynthese zu einem eukaryotischen Luciferin.

Bei einigen biolumineszierenden Pilzarten beherbergt der genomische Cluster ein oder zwei zusätzliche Gene (Abb. 1C): einer gehört zur Cytochrom P450-Familie und der andere zur Familie der Fumarylacetoacetathydrolasen., Letzteres (cph) kodiert wahrscheinlich eine Caffeylpyruvat-Hydrolase (Gruppe S4), die am Oxyluciferin-Recycling beteiligt ist, im Einklang mit Caffeylpyruvat, dem Pilz-Oxyluciferin, das durch eine Hydrolase in Pilzrohextrakten zu Caffeat und Pyruvat hydrolysiert wird (22).

Die Erhaltung des Genclusters legt nahe, dass sich die Biolumineszenz im Gegensatz zu anderen Gruppen biolumineszierender Organismen (23) nur einmal in Pilzen entwickelte, wobei luz -, h3h-und hisps-Gene durch Genverdopplungen hervorgingen. Rekonstruierte phylogenetische Bäume für luz -, h3h-und hisps-Gene (SI Anhang, Abb., S4-S6) und die Art Baum der Ordnung Agaricales (Abb. 2) offenbaren Sie die Entwicklung der Biolumineszenzkaskade in Pilzen. Das primäre Luz-Enzym der Pilz-Biolumineszenzkaskade entstand durch eine Gen-Duplikation an der Basis von Agaricales, gefolgt von der Duplikation von h3h und hisps einige Millionen Jahre später. Interessanterweise sind viele Arten in einer großen Klade, die Hisps kodiert, nicht biolumineszierend, und den Hisps-Homologen in biolumineszierenden Arten fehlen zwei Domänen, die Ketoreduktase-und Dehydratase-Domänen (SI Anhang, Abb. S6)., Es ist wahrscheinlich, dass der Verlust dieser funktionellen Domänen im gemeinsamen Vorfahren von Biolumineszenzarten die Produktion von α-Pyronen durch angestammte Hisps begünstigte, was möglicherweise den letzten Schritt für die Entstehung von Biolumineszenz darstellt.

Der Gencluster entwickelte sich nach dem Erwerb der Biolumineszenz dynamisch weiter. Mindestens sechs unabhängige vollständige oder teilweise Genverlustereignisse von Genen aus dem Genomcluster führten zu einem sekundären Verlust der Biolumineszenz (Abb. 2). Das cph-Gen wurde in den Cluster in der nonmycoiden Klade eingefügt, möglicherweise zweimal (Abb. 1)., Dieses Mosaikmuster ähnelt der Evolutionsgeschichte fluoreszierender Proteine (24), einer anderen visuell relevanten Proteinfamilie mit unklarer biologischer Rolle, und kann darauf hindeuten, dass der selektive Vorteil der Biolumineszenz bei Pilzen von einem spezifischen oder vorübergehenden ökologischen Kontext abhängt.

Komplexe Anpassungen können eine Quelle biotechnologisch relevanter Lösungen sein., Neben der Aufdeckung der Natur grundlegender photochemischer Prozesse und der Proteinentwicklung gehören Luciferasen zu den primären Arten von Reportergenen, die in verschiedenen Forschungspipelines, Diagnosemethoden und Umweltanwendungen verwendet werden (5, 6, 25). Um festzustellen, ob ein Pilz-Biolumineszenzweg Reportergene liefern kann, haben wir nnLuz in vitro charakterisiert und seine Fähigkeit getestet, Licht in heterologen Systemen zu produzieren.

Das nnLuz-Protein besteht aus 267 Aminosäuren und hat eine molekulare Masse von etwa 28,5 kDa (SI Anhang, Abb. S7)., Obwohl seine zelluläre Lokalisation in vivo unbekannt bleibt, weist das Protein eine vorhergesagte N-terminale Transmembranhelix auf, die mit der Kolokalisierung der Luciferaseaktivität mit unlöslichen Zellfraktionen in früheren Studien übereinstimmt (22). Bei der Expression in P. pastoris war nnLuz mit der mikrosomalen Fraktion assoziiert (SI Anhang, Abb. S8) und emittierte grünes Licht mit einem Maximum bei 520 nm und einem Spektrum, das mit dem von N. nambi-Myzel identisch ist (Abb. 3A und SI-Anhang, Abb. S9). Rekombinante nnLuz emittiert Licht optimal bei etwa pH 8.,0 und moderate Temperaturen, verliert seine Aktivität bei Temperaturen über 30 °C (SI-Anhang, Abb. S10).

Um das Potenzial von nnluz als Reportergen in heterologen Systemen zu testen, testeten wir seine Expression in Escherichia coli, P. pastoris, frühen Xenopus laevis-Embryonen und menschlichen Zellen., Obwohl Luciferase meist in menschlichen Körpern akkumuliert, wenn sie in Bakterien exprimiert wird (SI Anhang, Abb. S7) waren alle getesteten Zellen und Organismen, die Wildtyp-nnluz exprimierten, eindeutig biolumineszierend, wenn dem Medium 3-Hydroxyhispidin zugesetzt wurde (Abb. 3 und SI-Anhang, Abb. S11 und S22). Wir haben nnLuz auch qualitativ mit der Luciferase aus dem Firefly Photinus pyralis in einem Ganzkörper-Bildgebungs-Setup von Tumor-Xenografts bei Mäusen verglichen. Wir s. c., implantierte gleiche Mengen muriner Kolonkarzinomzellen, die entweder nnluz oder Firefly Luciferase unter demselben Promotor exprimierten, injizierte eine Mischung aus Firefly und fungalen Luciferinen i. p. und erhielt fast identische Signale von den Implantaten (Abb. 3C).

Schließlich wollten wir testen, ob die Luciferin-Biosynthese in Organismen ohne Kaffeesäure-Biosynthese erreicht werden kann. Einführung von drei zusätzlichen Genen, die für Enzyme der Kaffeesäure-Biosynthese aus Tyrosin, Rhodobacter capsulatus Tyrosin-Ammoniak-Lyase und zwei E kodieren., coli-4-Hydroxyphenylacetat-3-Monooxygenase-Komponenten (26) in das Genom des P. pastoris-Stammes, der npgA -, hisps -, h3h-und luz-Gene trägt, führten zu einem Stamm, der autonom biolumineszierend war, wenn er in einem Standardhefe-Medium (SI) angebaut wurde, Feigen. S12 und S16).

Daher ist die Wildtyp – N. nambi-Luciferase unter allen getesteten Bedingungen in heterologen Systemen funktionell und positioniert sich als vielversprechendes Reportergen, und Pilz-Luciferin kann aus aromatischen Aminosäuren in anderen Eukaryoten synthetisiert werden., Darüber hinaus ist Fungal Luciferin eine wasserlösliche und zelldurchlässige Verbindung, und seine lichtemittierende Reaktion hängt nicht von der Verfügbarkeit von ATP ab, was das Pilz-Biolumineszenzsystem für zahlreiche Anwendungen in der biomedizinischen Bildgebung attraktiv macht. Darüber hinaus können verschiedene Luciferin-Analoga verwendet werden, um die Lichtemission zu verbessern und ihre Spektren abzustimmen, wodurch die Lichtdurchdringung in tiefen Gewebebildgebungsanwendungen verbessert wird (22).

Abschließend stellen wir die enzymatische Kaskade vor, die zur Lichtemission in Pilzen führt, ein eukaryotisches Biolumineszenzsystem mit bekannter Biosynthese von Luciferin., Wir haben gezeigt, dass Luciferin aus seinem Vorläufer Hispidin von N. nambi H3H synthetisiert wird und dass Hispidin direkt durch Hispidinsynthase aus Kaffeesäure synthetisiert werden kann, einem weit verbreiteten zellulären Metaboliten mit effizienter Biosynthese, die in verschiedenen Organismen, einschließlich industriell relevanter Hefestämme, erreicht wurde (26)., Nur zwei enzymatische Schritte von den gängigen Stoffwechselwegen entfernt, hat das Pilzsystem ein hohes Potenzial für die synthetische Biologie, um autonom leuchtende Tiere und Pflanzen zu schaffen: Versuche, solche Organismen zu entwickeln, wurden bisher durch die schlechte Leistung des bakteriellen Biolumineszenzsystems, des einzigen Systems, für das die Luciferin-Biosynthese bekannt war, in Eukaryoten eingeschränkt (27, 28).

Die Rekonstitution von Pilz-Biolumineszenzwegen in eukaryotischen Organismen könnte Anwendungen ermöglichen, bei denen Gewebe oder Organismen Veränderungen in ihrem physiologischen Zustand mit autonomer Lichtemission melden., Es könnte auch die Entwicklung der nächsten Generation organischer Architektur vorantreiben (29), in der gentechnisch veränderte leuchtende Pflanzen in Gebäude und städtische Infrastruktur integriert werden. Abgesehen davon ist das hier vorgestellte Pilz-Biolumineszenzsystem mit seiner faszinierenden Evolutionsgeschichte, einer Familie von Luciferasen und seiner allgemeinen Einfachheit ein molekularer Spielplatz mit zahlreichen Möglichkeiten für Grundlagenforschung und angewandte Forschung.,