Sienistä

• bioluminescence
• sieni luciferin biosynteesi
• sieni luciferase

Bioluminesenssi on luonnollinen ilmiö valon päästöjä, jotka johtuvat hapettumisen alustan, luciferin, katalysoivat entsyymi, luciferase. Eri lajeja ovat bioluminescent luonne (1); monille heistä, kyky päästää valoa on piirre niiden biologia (2⇓-4). Luonnollisten bioluminesenssireaktioiden keinotekoisesta integroinnista eläviin järjestelmiin on tullut myös raportointiväline, jota käytetään laajalti molekyyli-ja solubiologiassa (5, 6)., Luonnolliset bioluminesenssijärjestelmät ovat kuitenkin huonosti luonnehdittuja biokemiallisella tasolla, mikä rajoittaa laajempaa soveltamista. Vain 9 luciferins ja 7 luciferase geeni perheitä on kuvattu (7, 8) vähintään 40 bioluminescent järjestelmien ajatellut luonnossa (9). Valitettavasti vain yksi biokemiallinen kaskadi, joka alkaa laajalle levinneestä metaboliitista lusiferiiniksi, on kuvattu kokonaisuudessaan (10). Kuvattu reitti on bakteeriperäinen ja sen käyttö eukaryooteissa on vähäistä (11)., Yhtään eukaryoottista bioluminesenssijärjestelmää ei ole kuvattu riittävän yksityiskohtaisesti, jotta se voitaisiin ilmaista toisessa organismissa tai luoda keinotekoisia autonomisesti bioluminesoivia organismeja. Tässä kuvataan sienten neonothopanus nambin bioluminesenssista vastuussa olevien keskeisten geenien toimintaa ja evoluutiota ja osoitetaan, että sienigeenien ilmentyminen riittää autonomisesti bioluminoivien eukaryoottien valmistamiseen.

noin 100 agaricales-lahkoon kuuluvaa sienilajia säteilee valoa käyttäen samaa biokemiallista reaktiota (12)., Vaikka niiden bioluminesenssin ekologista roolia ei täysin ymmärretä, on näyttöä siitä, että sienet saattavat houkutella itiöitä levittäviä hyönteisiä (13). Sienibioluminesenssin tiedetään käyttävän ainakin neljää komponenttia: molekyylihappea, 3-hydroksihispidiiniksi äskettäin tunnistettua luciferiiniä ja kahta aiemmin luokittelematonta avainentsyymiä, NAD(P)H-riippuvaista hydroksylaasia ja luciferaasia (15, 16).

tunnistaaksemme sienibioluminesenssireitin entsyymit keskityimme ensin luciferaasigeenin eristämiseen. Ilmaisemalla N., nambi cDNA kirjasto Pichia pastoris ja ruiskuttamalla agar levyt synteettinen 3-hydroxyhispidin, tunnistimme ja sekvensoitu luminescent hiiva siirtomaa ilmentävät luciferase geeni (SI-liite, viikunat. S1 ja S13). N. nambi-luciferaasi eli nnLuz on 267-aa-proteiini(SI-liite, Kuva. S2), eikä sillä ole kuvattuja homologeja tai lausuttua sekvenssin samankaltaisuutta säilytettyjen proteiinialueiden kanssa, jotka edustavat uutta proteiiniperhettä.

sekundaarisia metaboliitteja syntetisoivia entsyymejä koodaavat geenit klusteroidaan usein sienigenomeihin (17)., Me arveltu, että tämä saattaa olla tapauksessa entsyymien bioluminescent cascade, koska se on ajatellut, että cascade on säilytetty keskuudessa suurempi bioluminesenssi sienet (12). Etsimme siis luciferiinin biosynteesiin liittyviä geenejä N. nambin genomin luciferaasigeenin läheisyydestä. Lisäksi N. nambi, me myös sekvensoitiin genomien ja transcriptomes ja suurempi bioluminesenssi sienet Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, ja Panellus stipticus ja vertasi niitä julkisesti saatavilla genomin sekvenssit suurempi bioluminesenssi ja nonbioluminescent sienet (18, 19)., Selvitimme, että luciferaasi kuuluu säilyneeseen geenijoukkoon, johon kuuluu ainakin kaksi muuta geeniä: h3h ja hisps (viikuna. 1 B ja C sekä tietokokonaisuudet S1–S3).

H3h-geeni osoitti sekvenssien samankaltaisuuden 3-hydroksibentsoaatti 6-monooksygenaasien kanssa, entsyymit, jotka katalysoivat 3-hydroksibentsoaatin hapettumista NADH: n ja molekyylihapen avulla. Tämä reaktio on identtinen sen kanssa, joka muuttaa hispidiinin luciferiniksi (viikuna. 1A); siten oletimme, että h3h-geenin koodit hispidin-3-hydroksylaasi (H3H), entsyymi vastaa ennustettua hydroksylaasia (15)., Kloonasimme N. nambin geenin ja huomasimme, että P. pastoris-pesäkkeet, jotka ilmentävät sekä nnluzia että nnh3h: ta, säteilevät valoa sumutettaessa luciferiinin esiasteella hispidin, toisin kuin kontrolliyhdyskunnat, jotka ilmentävät nnluzia yksin (SI-liite, viikunat. S14 ja S17) – vahvistaa, että nnH3H muuntaa hispidinin luciferiniksi.

hisps-geeni (Kuva. 1C) koodaa polyketidisyntaasiperheen jäsentä, entsyymejä, jotka tuottavat sekundaarisia metaboliitteja erilaisissa eliöissä elämänpuun poikki (20)., Polyketidisyntaasit lisäävät tyypillisesti malonyylimoita kasvavaan hiiliketjuun; näin hispidiinin α-pyroniluonne antoi ymmärtää, että sen biosynteesi voidaan suorittaa kofeiinihaposta valmistetulla polyketidisyntaasilla kahdella malonyyliyksiköiden lisäysketjulla, joita seuraa laktonisaatio (Kuva. 1a ja SI-liite, Kuva. S3). Suuri modulaarinen polyketide syntaasien vaativat posttranslational muutoksia niiden toimintaa (21), kuten siirto phosphopantetheinyl ryhmän säilytetty seriini jäännös asyyli harjoittaja proteiini domain., Testata, onko hisps geeni voi tuottaa luciferin esiasteena heterologista järjestelmän, me integroitu hisps, nnluz, ja nnh3h geenit yhdessä Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl koodaavan geenin npgA genomiin P. pastoris. Viljeltynä kofeiinihappoa sisältävässä väliaineessa hiivat, jotka ilmentävät kaikkia neljää geeniä, jotka päästävät valoa paljain silmin (Kuva. 3A), vaikka merkittävää valontuotantoa ei havaittu kannoissa, joilla ei ollut npgA-tai hisps-geenejä (SI-liite, viikunat. S15 ja S17)., Siksi, hisps katalysoi synteesi hispidin alkaen kofeiinihappoa, sulkeminen ketju reaktioita (myös ”kofeiinihappoa sykli”) yhteinen cellular metaboliitti, joiden tiedetään biosynteesi on aitotumallisilla luciferin.

eräissä bioluminesenssilajeissa genomiklusteriin mahtuu yksi tai kaksi muuta geeniä (Kuva. 1C): yksi sytokromi P450-perheeseen kuuluvista ja toinen fumaryyliasetoasetaattihydrolaasien perheeseen kuuluvista., Jälkimmäinen (cph) todennäköisesti koodaa oksyylikiferiinin kierrätykseen osallistuvaa kofeeyylipyruvaattihydrolaasia (Dataset S4), joka on yhdenmukainen kofeyylipyruvaatin, sienioksyylikiferiinin kanssa, hydrolysoidaan kofeeaatiksi ja pyruvaatiksi sieniraaka-uutteissa esiintyvän hydrolaasin avulla (22).

geenirykelmän säilyminen viittaa siihen, että toisin kuin muut bioluminesenssiorganismiryhmät (23), bioluminesenssi kehittyi sienissä vain kerran, kun Luz, h3h ja hisps-geenit kehittyivät geenien päällekkäisyyksien kautta. Rekonstruoidut fylogeneettiset puut luzille, h3h: lle ja hisps-geeneille (SI-liite, viikunat., S4-S6) ja lahkon ”agaricales” lajipuu (viikuna. 2) paljastaa bioluminesenssikaskadin evoluution sienissä. Sienibioluminesenssikaskadin ensisijainen luz-entsyymi syntyi agaricalesin tyvessä olevan geenin monistuman kautta, jota seurasi h3h: n ja hispsin kahdentuminen muutamaa miljoonaa vuotta myöhemmin. Mielenkiintoista, monet lajit suuren haaran koodaus hisps ovat nonbioluminescent, ja hisps homologeista, jotka vuonna bioluminescent laji puuttuu kaksi verkkotunnukset, ketoreductase ja dehydratase verkkotunnukset (SI-Liite, Kuva. S6)., On todennäköistä, että näiden funktionaalisten domeenien häviäminen bioluminesenssilajien yhteisessä esi-Isässä suosi α-pyronien tuotantoa esi-isien hispeillä, mikä mahdollisesti antoi lopullisen askeleen bioluminesenssin syntymiselle.

geenijoukko jatkoi dynaamisesti kehittymistään bioluminesenssin saamisen jälkeen. Ainakin kuusi riippumatonta täydellistä tai osittaista geenien häviämistapahtumaa genomiklusterista johti sekundaariseen bioluminesenssin menetykseen(Kuva. 2). Cph-geeni työnnettiin klusteriin nonmycenoidikladiin, mahdollisesti kahdesti (viikuna. 1)., Tämä mosaiikki kuvio muistuttaa evoluutiohistoriasta fluoresoivia proteiineja (24), toinen visuaalisesti asiaa proteiinia perheen kanssa epäselvä biologinen rooli, ja voi ilmoittaa, että valikoiva etu toimittamien bioluminesenssi sienet riippuu erityisistä tai ohimenevä ekologinen yhteydessä.

Kompleksisovitukset voivat olla bioteknisesti merkityksellisten ratkaisujen lähde., Sen lisäksi, että luciferaasit paljastavat valokemiallisten perusprosessien ja proteiinin evoluution luonteen, ne kuuluvat eri tutkimusputkistoissa, diagnostiikan menetelmissä ja ympäristösovelluksissa (5, 6, 25) käytettävien reportterigeenien ensisijaisiin tyyppeihin. Selvittääksemme, voiko sienibioluminesenssireitti tuottaa reportterigeenejä, luonnehdimme nnluzia in vitro ja testasimme sen kykyä tuottaa valoa heterologisissa järjestelmissä.

nnLuz proteiini koostuu 267 aminohappoja ja on molekyylimassa on noin 28.5 kDa (SI-Liite, Kuva. S7)., Vaikka sen solujen lokalisointia in vivo ei tunneta, proteiinilla on ennustettu n-terminaalinen transmembraani helix, joka vastaa luciferaasin aktiivisuuden kolokalisoitumista liukenemattomilla solujakeilla aiemmissa tutkimuksissa (22). Kun nnluz ilmaistiin P. pastoriksena, siihen liittyi mikrosomaalinen fraktio (SI-liite, Kuva. S8)ja säteili vihreää valoa maksimissaan 520 nm: ssä ja spektri on sama kuin N. nambi myceliumin (Kuva. 3a ja SI-liite, Kuva. S9). Rekombinantti nnLuz säteilee valoa optimaalisesti noin pH 8: ssa.,0 ja kohtalainen lämpötila, menettää aktiivisuutensa yli 30 °C: n lämpötiloissa (SI-lisäys, Kuva. S10).

testaa mahdollisuuksia nnluz kuin reportteri geeni heterologinen järjestelmät, testasimme sen ilme Escherichia coli, P. pastoris, varhainen Xenopus laevis alkioita, ja ihmisen soluja., Vaikka luciferase kertynyt lähinnä inkluusiokappaleiden, kun ilmaistaan bakteerit (SI-Liite, Kuva. S7), kaikki testatut solut ja organismit ilmentävät villin tyypin nnluz oli selvästi bioluminesenssi, kun 3-hydroksihispidiini lisättiin väliaineeseen (Kuva. 3 ja SI-liite, viikunat. S11 ja S22). Vertasimme nnluzia myös laadullisesti firefly Photinus pyralis-bakteerin luciferaasiin koko kehon kuvantamisasetuksessa, jossa hiirillä on kasvaimen xenograftteja. Me S. C., istutettu yhtä paljon hiiren paksusuolen syöpä solut, jotka ilmentävät joko nnluz tai firefly luciferase saman promoottorin ruiskutetaan seos, firefly ja sieni-luciferins minä.p., ja saadaan lähes identtisiä signaaleja implantit (Fig. 3 C).

lopulta pyrimme testaamaan, voidaanko luciferiinin biosynteesi saavuttaa eliöillä, joilla ei ole kofeiinihapon biosynteesiä. Käyttöönotto kolme muita geenejä, jotka koodaavat entsyymejä kofeiinihappoa biosynteesiä tyrosiini, Rhodobacter capsulatus tyrosiini ammoniakkia lyase ja kaksi E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase komponentit (26), genomiin P. pastoris-kanta kuljettaa npgA, hisps, h3h, ja luz geenien tuloksena on kanta, joka oli itsenäisesti bioluminescent kun kasvanut standardi hiiva medium (SI Lisäys, Viikunat. S12 ja S16).

Näin ollen alle kaikki testattu olosuhteissa, villi-tyyppi N. nambi luciferase on toiminnallinen heterologinen järjestelmät, paikannus itsensä lupaava reportteri geeni-ja sieni-luciferin voidaan syntetisoida aromaattisia aminohappoja muissa eukaryooteissa., Lisäksi sienilusiferiini on vesiliukoinen ja soluläpäisevä yhdiste, eikä sen valoa lähettävä reaktio ole riippuvainen ATP: n saatavuudesta, mikä tekee sienibioluminesenssijärjestelmästä houkuttelevan lukuisiin sovelluksiin biolääketieteellisessä kuvantamisessa. Lisäksi erilaisia luciferin-analogeja voidaan käyttää parantamaan valon päästöjä ja virittämään spektriään parantaen valon läpäisyä syväkudoskuvaussovelluksissa (22).

lopuksi esittelemme entsymaattisen kaskadin, joka johtaa valopäästöihin sienissä, joka on eukaryoottinen bioluminesenssijärjestelmä, jolla tiedetään olevan luciferiinin biosynteesi., Olemme osoittaneet, että luciferin syntetisoidaan sen edeltäjä hispidin N. nambi H3H ja että hispidin voidaan suoraan syntetisoida hispidin nopaliinisyntaasin alkaen kofeiinihappoa, on laajalle levinnyt, cellular metaboliitin tehokas biosynteesiin, joka saavutettiin eri organismien, mukaan lukien teollisesti asiaa hiivan kantoja (26)., Vain kaksi entsymaattista askelta valtavirran metaboliareiteistä, sienijärjestelmällä on suuri mahdollisuus synteettisen biologian luoda autonomisesti hehkuvia eläimiä ja kasveja: yritykset kehittää tällaisia organismeja ovat toistaiseksi rajoittaneet bakteerien bioluminesenssijärjestelmän heikkoa suorituskykyä eukaryooteissa, ainoa järjestelmä, jolle luciferin biosynteesi tunnettiin (27, 28).

sienibioluminesenssireitin käyttövalmiiksi saattaminen eukaryoottisissa organismeissa saattaa mahdollistaa sovellukset, joissa kudokset tai organismit ilmoittavat fysiologisessa tilassaan tapahtuvista muutoksista, joilla on itsenäinen valopäästö., Se saattaa myös edistää seuraavan sukupolven orgaanisen arkkitehtuurin kehittämistä (29), jossa muuntogeeniset hehkutuslaitokset integroidaan rakennuksiin ja kaupungin infrastruktuuriin. Sen lisäksi, että sen kiehtova evolutionaarinen historia, perhe luciferases, ja yleinen yksinkertaisuus, sieni bioluminescent järjestelmä esitetty tässä on molekyyli leikkipaikka, jossa on lukuisia mahdollisuuksia perus-ja soveltavan tutkimuksen.,

kuittaukset

Kiitämme Sergei Šakhovia valokuvauksesta ja Mary Katariina Aimea ja Rachel Kochia siitä, että he sallivat meidän käyttää G. necrorhiza MCA 3950: N genomista saatuja tietoja. Kokoonpano plasmidit kokeiluja nisäkässoluissa ja Xenopus alkioiden tukivat venäjän Tiede-Säätiö Myöntää 17-14-01169, ja biokemiallinen karakterisointi luciferase tukivat venäjän Tiede-Säätiö Myöntää 16-14-00052. Tätä tutkimusta tukivat Planta LLC ja Evrogen JSC., IVIS-kuvantaminen ja eläinkokeet tehtiin käyttäen laitteita keskus kollektiiviseen käyttöön ”Medical Nanobiotechologies” sijaitsee Venäjän National Research Medical University. Kokeet toteutettiin osittain Venäjän tiedeakatemian ydinlaitoksen Bioorgaanisen kemian laitoksen (CKP IBCH; Venäjän opetus-ja tiedeministeriön apuraha RFMEFI62117X0018) toimittamilla laitteilla. T. G. ja M. M.-H., myöntää tukea Espanjan talous-ja Kilpailukykyministeriön myöntämälle avustukselle BFU2015-67107, jota rajoittavat Euroopan aluekehitysrahasto, Euroopan tutkimusneuvoston (ERC) avustus ERC-2012-StG-310325 Euroopan unionin seitsemännen puiteohjelman FP7/2007-2013 sekä Marie Sklodowska-Curie-apurahan H2020-MSCA-ITN-2014 mukainen Euroopan unionin Horisontti 2020-tutkimus-ja innovaatio-ohjelma 642095. FBI.,tuki Hhmi International Early Career Scientist Program 55007424, Espanjan talous-ja Kilpailukykyministeriö (MINECO) myöntää BFU2012-31329 ja BFU2015-68723-P, MINECO Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 Grant SEV-2012-0208, Secretaria d ’universitats i Recera del Departament d’ Economia i Coneixement de la Generalitat ’ s Agency for management of University and research grants program 2014 SGR 0974, centres de recerca de Catalunya programme of the Generalitat de Catalunya, and ERC Grant 335980_EIMME Union seventh Framework Programme FP7/2007-2013., H. E. W., A. G. O., ja V. S. myönnettävä tuki São Paulo Research Foundation (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Avustukset 11/10507-0 H. E. W.), 10/11578-5 (A. G.-O.), ja 13/16885-1 (V. S.).