… based BactoScan FC, joka käyttää etidiumbromidia bakteerien tahraamiseen maidossa, tuottaa tuloksen 8 min (5, 30) jälkeen. Virtaus – cytometric tekniikka mittaus-TBC raaka ja ultrahigh – lämpötila maidon kanssa tahra SYTO BC on myös kuvattu aiemmin (16). Kuitenkin, nämä tekniikat ovat joko hyvin erityinen, havaita vain yksi laji, tai epäspesifinen, havaita kaikki bakteerit., Virtaussytometrisiä menetelmiä maidon bakteerien eriyttämiseksi suurempiin ryhmiin, kuten grampositiivisiin ja gramnegatiivisiin bakteereihin, ei ole vielä kuvattu. Gram-värjäys oli alunperin kuvattu vuonna 1883 Christian Gram-kollega Carl Friedlander, jakaa bakteerit kahteen ryhmään, ja jälleen vuonna 1884 Christian Gram (12, 14). Tavanomaiseen Gramvärjäysmenettelyyn kuuluvat tahrat kidevioletti ja safraniini. Lämpö-kiinteä solujen dian värjätään sininen-violetti kristalli violetti, ja sen jälkeen ne käsitellään etanolilla., Gramnegatiiviset bakteerit dekolorisoituvat etanolin vaikutuksesta, kun taas grampositiiviset bakteerit jäävät kidevioletin värjäämiksi. Tämän jälkeen safraniinia käytetään gramnegatiivisten bakteerien torjuntaan, mikä antaa tälle ryhmälle vaaleanpunaisen ulkonäön. Gram-reaktion tunnistamiseksi on raportoitu lukuisia vaihtoehtoisia lähestymistapoja. Menetelmää, jossa bakteeriyhdyskunnalle altistetaan 3% kaliumhydroksidia, käytetään laajalti. Kaliumhydroksidin suuri pitoisuus lyseeraa gramnegatiivisia bakteereja vapauttaen soluista DNA: ta, joka voidaan vahvistaa vetämällä viskoosinen naru pesäkkeestä (15, 26)., On kuvattu vaihtoehtoinen Gram-värjäystekniikka, jossa käytetään fluoreseiinikonjugoitua lektiinivehnägglutiniinia (WGA) yhdistetyssä epifluoresenssissa ja faasikontrastimikroskoopissa (29). WGA sitoutuu n – asetyyliglukosamiiniin soluseinän pep-tidoglykaanikerroksessa. Gramnegatiivisilla bakteereilla on soluseinän peittävä lipopolysakkaridikerros, minkä vuoksi niitä ei värjätä WGA: lla, kun taas grampositiiviset bakteerit värjätään WGA: lla, koska niillä ei ole lipopolysakkaridikerrosta., Nämä tulokset osoittivat, että viljelmän ikä ei ollut riittävän tunteellinen, mikä viittasi siihen, että tahraa voitiin käyttää suoraan näytteisiin ilman näytteen prekultivointia. On modi-fi-ed-versio WGA-tekniikka on kuvattu bakteereja löytyy muut kuin elintarvike ympäristö, jossa bakteerit ovat immobilisoitu fi suodin, pestään, ja sitten värjätään WGA (11). Myös joitakin Gramvärjäystekniikoita FL ow-sytometriaan on ehdotettu. Yksi käyttää fl-fosesoiva lipofiilinen tahra rho – damine 123, joka valikoivasti värjää grampositiivisia bakteereja., Gramnegatiivisten bakteerien lipopolysakkaridikerros edeltää rhodamiini 123: n (1, 28) tuloa. Toisessa vastaavassa tekniikassa yhdistyvät kaksi FL: n UV-säteilevää DNA: n sidontatahraa, SYTO 13 ja heksidiumjodidi (HI). SYTO 13 on solukalvon läpäisevä tahra, ja HEI on estänyt lipopolysakkaridi kerros gram-negatiivisia bakteereja, ja siten vain läpäisevä gram-positiivisia bakteereita ja gram-negatiivisten bakteerien kanssa de – vakiintunut lipopolysakkaridi kerros (22). Lipopolysakkaridikerroksen haurauden vuoksi näiden tekniikoiden ei kuitenkaan uskota soveltuvan viljelemättömiin näytteisiin., Nykyisen työn tavoitteena on ollut kehittää Gramvärjäystekniikka, joka perustuu bakteerien värjäämiseen WGA: lla ja HI: llä ja jota seuraa FL ow: n sytometrinen havaitseminen. Tekniikka oli arvioida maidon-liittyvät bakteerit (19, 20) stationäärifaasin ja sen jälkeen 6, 12 ja 48 h inkuboinnin laboratorio – media. Lisäksi menetelmää on testattu kanava – ary-vaihe kulttuureissa, jotka oli varastoitu 24 h Ϫ 18 ° C ja 14 päivän ajan 5 ° C. Lopuksi, tekniikka on sovellettu bulk säiliö maitoa, johon on sekoitettu tunnettuja bakteereja., Menetelmä grampositiivisten ja gramnegatiivisten bakteerien erottamiseksi irtotavarana olevasta säiliömaidosta ilman prekultivaatiota on lopullinen AP-plikaatio. Kuva 1 osoittaa vaikutus KCl-pitoisuus on sitova ja WGA, että gram-positiivisia bakteereja, M. luteus ja S. uberis , kun bakteerit ovat värjätään WGA yksin, ilman HI. Histogrammeissa kohina näkyy vasemmalle, jonne on kerääntynyt tapahtumia, joissa on matalia FL-uorescence-intensiteettejä (puimavanhalla leikattiin pois suurin osa kohinasta)., Kun bakteerit värjätään kitkerästi erottaakseen ne melusta, ne näkyvät huippuna, joka on täysin erotettu melusta. 0 M KCl: n avulla yksikään kahdesta bakteerista ei värjäytynyt tarpeeksi erottaakseen ne melusta. Käytettäessä 1 M KCl: ää havaittiin kummankin bakteerin lisääntynyt FL – ures-cence-intensiteetti. M. luteus erotettiin tämän jälkeen melusta, ja S. uberis vain hieman ylipelasi kohinaa. Lisää KCl-pitoisuus 3 M entisestään sitova (korkeampi fl uorescence intensiteetit) WGA näiden bakteerikantojen, erityisesti M. luteus ., Mikroskooppiset havainnot osoittivat, että gram-positiiviset bakteerit olivat värjätään WGA, kun taas gram-negatiiviset bakteerit eivät värjätään WGA. HI värjäsi sekä grampositiiviset että gramnegatiiviset bakteerit. Kuvassa 2 on esitetty esimerkki värjäys seos (1:1) gram-positiivinen M. luteus ja gramnegatiivinen E. coli sekä WGA ja HI. Värjäyksen seurauksena M. luteus ilmestyi vihreällä pinnalla (WGA) ja punaisella sytoplasmalla (HI), kun taas E. coli esiintyi vain punaisella sytoplasmalla. E. coli-bakteeriviljelmien isometriset analyysit fl ow cyto – metrisistä analyyseistä, M., luteus ja näiden seos (1: 1) on esitetty kuvassa. 3. Pelkän kolibakteerin mittaaminen (Kuva. 3a), 100% tapahtumista oli läsnä gramnegatiivisella alueella. M. luteus yksin (Kuva. 3B), 99% tapahtumista oli grampositiivisella alueella ja 1% tapahtumista gramnegatiivisella alueella. Kun E. coli-ja M. luteus-viljelmät sekoittuivat (Kuva. 3C), 50% tapahtumista havaittiin kullakin alueella. Jokainen 12 bakteerikannasta mitattiin kahtena kappaleena 6,12, 24 ja 48 tunnin inkubaation jälkeen. Jokaisesta mittauksesta laskemiseen käytettiin 100 tapahtumaa. Kuvassa., 4 esitetään koottu juoni, joka sisältää kaikki 800 tapahtumaa kutakin 48 tunnin inkubaation aikana testattua 12 bakteerikantaa kohti (yhteensä 9 600 tapahtumaa). Jokainen bakteerikanta on esitetty eri värillä. Grampositiivisten ja gramnegatiivisten bakteerien erottamiseen esitetään laskettu paras raja. Kaiken kaikkiaan linja varmisti, että 97 prosenttia tapahtumista tulkittiin oikein. Yksittäisten kantojen osalta oikein tulkittujen solujen prosentuaaliset osuudet on calculated, ja ne on esitetty taulukossa 1. E. cloacae, E. coli, K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae, S., dys – galactiae , ja S. uberis , lähes kaikki solut ( Ͼ 96%) olivat oikein tulkita mitään inkuboinnin ajan. B. cereus , P. fl uores – cens , ja P. putida , Ͼ 93% soluista oli tulkita oikein sen jälkeen, kun 12-ja 24 h inkuboinnin, kun ottaa huomioon, että 6 ja 48 h inkuboinnin vain 75 89% soluista oli tulkittu oikein. Taulukossa 2 esitetään tulokset erilaisista säilytysolosuhteista kärsivien tul-turesin sytometrisistä määrityksistä., Kun viljelmiä säilytettiin 5 ° C: ssa 14 päivän ajan, värjäystekniikka näytti olevan fl: ssä viljelmän iän mukaan, erityisesti gramnegatiivisten bakteerien kohdalla. Oikein tulkittujen solujen keskimääräinen osuus oli 86 prosenttia. E. coli -, M. luteus -, S. agalactiae -, S. dysgalactiae-ja S. uberis-bakteereissa useimmat solut ( Ͼ 97%) tulkittiin oikein. B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis ja S. aureus tulkitsivat oikein 76-89% ja P. fl uorescens ja P. putida puolestaan 58%., Jäätyminen ei tuntunut likaantumistekniikalta. Kun solut on säilytetty Ϫ 18 ° C: ssa 24 tunnin ajan, Ͼ 98% soluista tulkittiin oikein E. cloacae -, E. coli -, K. oxy-toca -, L. lactis -, P. putida -, S. aureus -, S. agalactiae -, S. dysgalactiae-ja S. uberis-bakteereille . B. cereus ja P. fl uorescens olivat 83% ja P. FL uorescens 82%. Kuvassa 5 esitetään S. aureus-bakteerin ja E. coli – bakteerin isometriset havaintoalat, jotka on lisätty irtotavarana olevaan säiliömaitoon. S. aureus (Kuva. 5A), 98% tapahtumista oli grampositiivisella alueella ja 2% tapahtumista gramnegatiivisella alueella., Kolibakteeri (Kuva. 5B), 96% tapahtumista oli gramnegatiivisella alueella ja 4% tapahtumista gram – posi-tiive – alueella. Maidossa olevien luonnollisten bakteerien osuus oli alle 0,1 prosenttia. Suuren KCL-pitoisuuden lisääminen värjäysliuokseen paransi WGA: n kykyä tahrata grampositiivisia bakteereja. Mahdollinen selitys on, että grampositiivisilla bakteereilla on soluseiniinsä kohtisuorasti kiinnittyneitä teikhoehappoja, jotka voivat joidenkin grampositiivisten bakteerien kohdalla estää WGA: n pääsyn soluseinään., Kun KCl-pitoisuus on alhainen, rakenne teichoic happoja on jäykkä, mutta lisäämällä pitoisuutta KCl -, rakenne on löystynyt, kuten kalium-ioneja poistamaan kielteisiä maksuja teichoic happoja, jolloin rakenne romahtaa (8, 9). Koostumus ja rakenne teichoic happoja vaihdella välillä gram-positiivisia lajeja (24), mikä saattaa selittää, miksi kasvu KCl-pitoisuus 1-3 M oli suurempi vaikutus M. luteus kuin S. uberis . Nykyisessä työssä käytettiin 3 M KCl: ää maksimoimaan WGA: n sitoutuminen grampositiivisiin bakteereihin., Teikhappojen organisaation eliminointitekniikoita on raportoitu ennen viivytystä vain mikroskooppisissa sovelluksissa. Näitä tekniikoita ovat osmiumtetroksidi Fi xation fol – lowed by asetoni addition and haihduttamalla (2) ja lämpö Fi xa – tion bakteerien mikroskooppinen dia (29). Näitä hoitoja ei kuitenkaan voitu ottaa huomioon tässä tutkimuksessa, sillä nestehukka ei sovellu sytometriaan., Gramvärjäystekniikalla saatiin luotettavia tuloksia kaikista kannoista 6, 12, 24 ja 48 tunnin inkubaation jälkeen, ja lähes kaikki (97%) solut tulkittiin oikein. Nämä tulokset muotoutuvat uudelleen siirretyn WGA-gram-värjäysmenetelmän Fi-kohtiin …