1 Johdanto
Kiinteä kalvo proteiineja muodostavat suuren osan genomien monet organismit—noin 25% ihmisen genomin—ja suorittaa erilaisia toimintoja, mukaan lukien keskeiset vaiheet viestintää solu ja sen ympäristö., Koska niiden biologinen ja terapeuttinen merkitys (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), kalvoproteiinit ovat perus-ja sovelletun biofyysisen tutkimuksen painopiste, joka luonnehtii kolmiulotteisia rakenteita, dynamiikkaa ja vuorovaikutuksia kotoperäisissä ympäristöissä.,
Solution-state NMR-spektroskopialla on ollut ratkaiseva merkitys membraaniproteiinibiofysikaalisissa tutkimuksissa, sillä tällaisilla lähestymistavoilla annetut paikkakohtaiset dynaamiset ja vuorovaikutustiedot täydentävät hienosti Röntgendiffraktiosta, cryo-emistä ja laskennallisista analyyseistä (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella Marassi, 2017)., Olennaista tällaiset tutkimukset ovat useita 2D ”sormenjälki spectra,” useimmiten 15N/1H HSQC (heteronuclear single quantum johdonmukaisuus) spektrit (selkäranka varten amidi plus Trp, Asn, ja Gln sidechains) tai metyyli 13C/1H HMQC (heteronuclear multiple quantum johdonmukaisuus) spektrien sidechain metyyli-ryhmien (Vaghn et al., 2008). Nämä metyyliohjatut kokeet ovat erityisen edullisia suurille, hitaasti tummeneville kalvoproteiini / lipidikomplekseille; kokeet, jotka on suunnattu muille sidekainin ja pääketjukohteille, on onnistuneesti sovellettu myös., NMR–kokeet voivat antaa tietoa proteiinidynamiikasta monien aikakausien aikana, nopeista (ps–ns) sidechain-liikkeistä hitaisiin konformaatiomuutoksiin (µs-ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & harpoli, 2013)., Monet näistä dynamiikan kokeista, joissa käytetään usein sidekainimetyyliryhmiä luotaimina, on sovitettu ja kehitetty suurille biomolekyylijärjestelmille ja niitä voidaan käyttää kalvoproteiineihin (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
erityinen etu ratkaisu-state NMR on se, että proteiineja on tutkittu kotoisin-kuten ratkaisu tilaan, jossa ne voi interconvert joukossa useita conformations., Kalvoproteiinit on kuitenkin liuotettava sopivaan kalvomimeettiin, joka ylläpitää alkuperäistä rakennetta ja dynamiikkaa. Erilaisia vaihtoehtoja ovat pesuainemikellot, amfipolit, bikellit, nanodiscit, Smalpit ja lipidivesikkelit, joilla kullakin on omat etunsa ja haittansa (Liang & Tammi, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Se on usein tarpeen testata eri solubilization strategioita tietyn proteiinin näyte vakautta, signaalin intensiteetti ja resoluutio, ja natiivi rakenne/toiminta., Kaksi tärkeää näkökohtaa kaikille kalvomimeeteille ovat (1) yhtenäinen ja pieni hiukkaskoko ja (2) suuri deuteraatio.
korkean tason deuteraatio sekä membraanimimeettisessä että proteiinissa itsessään on ratkaisevan tärkeää spectrassa olevien 1h-signaalien määrän vähentämiseksi (mukaan lukien lipideistä peräisin olevat signaalit, jotka voivat olla voimakkaita) ja näytteessä jäljellä olevien NMR-aktiivisten pyöräytysten rentoutumisominaisuuksien parantamiseksi., Vaikka deuteraatio on mahdollista membraanimimeettiselle deuteroitujen yhdisteiden oston / synteesin kautta, 1H: n korvaaminen 2h: lla proteiineissa vaatii biosynteettistä inkorporaatiota. Sillä selkäranka kokeiluja aitotumallisilla ilmaisujärjestelmät, voi merkitä yhdenmukaisesti 15N tarkkailla kaikki amidit (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) tai lisäämällä erikseen merkittyjä aminohappoja (Isogai ym., 2016)., Esimerkiksi metyyli-ryhmiä, yksi voi tarjota joko asianmukaisesti merkitty aminohappoja tai aminohappo lähtöaineet (erityisesti alfa-keto happoja) kasvua media käyttää erilaisia merkintöjä kuvioita sidechains useita aminohappoja (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind-isoleusiini δ1-metyyliryhmät erityisen hyödyllisiä, kun otetaan huomioon (1) Ile-jäämien runsaus integraaleissa kalvoproteiineissa, mukaan lukien GPC (Ulmschneider & Sansom , 2001), (2) isoleusiini δ1-metyyliryhmien far upfield 13C-muutos, jolloin ne sijoittuvat 2D 13C/1h Spectran erityisen kasvamattomalle alueelle, (3) tarve määrittää nämä stereospesifisesti metyyliryhmät, toisin kuin Val ja leu, ja (4) metyyliryhmän ja Proteiinirungon välillä on useita vapaasti käännettäviä sidoksia, jotka tarjoavat merkittävän riippumattomuuden dynamiikasta näillä alueilla (kasinath et al.,, 2013).
vaikka monet edellä mainituista merkintästrategioista on kehitetty hyvin E. coli-bakteerille, monet integraaliset kalvoproteiinit voidaan ilmaista vain suurina määrinä eukaryoottisissa isännissä. Näistä methylotrophic hiiva Pichia pastoris on kätevä isäntä heterologinen ilmentyminen ja isotooppien merkintöjä aitotumallisilla kalvo proteiineja (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Edut Pichia ovat nopeus, geneettinen manipulaatio, korkean tuoton rekombinantti proteiini, olemassaolon posttranslational muutos (PTM) ja esiliina tarvittavat koneet aitotumallisilla kalvo proteiineja, ja kyky kasvaa määritelty minimaalinen media mahdollistaa perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Yhtenäinen isotooppimerkintä Pichiassa on vakiintunut (Morgan et al., 2000; Pickford & O ’ leary, 2004)., Olemme laajentaneet tätä työtä osoittamalla, 13C, 1H merkintöjä isoleusiini δ1-metyyli-ryhmien perdeuterated tausta lisäämällä merkitty α-ketobutyrate (~ 50% merkintöjä, ~ 90% deuteration) erittäin deuterated kasvua media (Clark et al., 2017, 2015). Sen sijaan leusiini δ – ja valiini γ-metyyliryhmien samanaikainen merkitseminen α-ketoisovaleraatin kanssa on tehotonta, mutta se voidaan saavuttaa lisäämällä valiini suoraan kasvualustoihin tai muokkaamalla viljelyolosuhteita (Clark et al., 2015; Suzuki ym., 2018; Zhang ym., 2017)., Pichia voi helposti kestää jopa ylimääräisiä aminohappoja media, yleinen korrelaatio oton tehokkuutta ja energinen kustannukset syntetisoimaan, että aminohappo tyyppi de novo (Heyland, Fu, Tyhjä, & Schmid, 2011). Soluunoton jälkeen merkittyjä aminohappoja voidaan kuitenkin syöttää metaboliareitteihin (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), laajentaa haluttujen aminohappojen signaalia ja vaikeuttaa isotooppisen scramblingin avulla tehtävää data-analyysia., Vaihtoehtoisesti voidaan kehittää auxotrofisia kantoja tietyn aminohapon merkitsemistä varten; on kuitenkin varmistettava, että muilla metaboliareiteillä ei ilmene muita kuin kohdevaikutuksia (Whittaker, 2007).
tässä esitetään yksityiskohtaiset protokollat, joita tarvitaan sellaisten U-2h (13C, 1h-Ile δ1 metyyli)-merkittyjen integraalisten kalvoproteiinien tuottamiseksi yli-ilmentymällä Pichiassa käyttäen mallijärjestelmänä ihmisen adenosiini A2A-reseptoria., Tarkemmin, miten tällaisia näytteitä voidaan käyttää ratkaisu NMR tutkimuksissa, hankkimisesta yksinkertainen 13C / 1H HMQC spectra, kautta chemical shift toimeksiannot sivuston suunnattu mutagenesis, analyysit 1h-1h cross-relaksaatio mittaukset nopeasti sidechain dynamics.