Charcoal-Striped fetal calf serum (KS.myös viite. 3)
1
lisätään 250 mg puuhiiltä ja 25 mg dekstraania T-70-100 ml sikiön vasikkaseerumia (FCS).
2
inkuboi 56°C: ssa 30 min.
3
sentrifugoidaan 3000-4000 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan huoneenlämmössä.
4
siirrä supernatantti tuoreisiin ämpäreihin.
5
toista aiemmat vaiheet.
6
suodata supernatantti prefilterin (tyyppi AP; Millipore, Bedford, MA) kautta hiilien poistamiseksi.
7
suodata liuos 0: n läpi.,45-µm huokoskokosuodatin (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
säilytä alikvotit -20°C: ssa.
liivate (10 × varasto)
1
tee 1% (w/v) liivateliuosta (G-2500; Sigma, St. Louis, MO)
2
Autoklaavi 20 min.
3
Säilytä 4°C: ssa.
Liivate-Pinnoitetut Astiat/Pullot
1
Laimenna liivate varastossa 10 kertaa.
2
Pipetoi tämä liuos astioihin, jotta astian pinta peittyy kokonaan (1, 5-2 ml annosta kohti 6 cm: n annosta).
3
jätä astiat huoneenlämpöön 2 tunnin ajaksi. Nopeuttaakseen tätä menettelyä ne voidaan asettaa hautomoon 37°C: ssa 1 tunnin ajaksi.,
4
Aspiroi astiat.
5
Kääri ruokia folioon ja säilytä niitä huoneenlämmössä tai 4°C.
HEBS-puskuria (10× varastossa)
1 2
Lisää double-tislattua vettä 975 ml.
3
Säädä pH 7.05 ja tilavuus 1000 ml.
4
Autoklaavi liuos ja säilytä se 4°C: ssa.
5
ennen käyttöä puskuriin lisätään suodatettu glukoosiliuos (KS. 2× HEPS-valmiste).
HEBS (2×)
1
laimenna HEBS 10× kanta viisi kertaa steriilillä H2O: lla.
2
Lisää 0, 2 ml suodatettua glukoosiliuosta (1 g / ml) 100 ml: aa kohti (lopullinen pitoisuus, 10 mM).,
3
Säädä pH 7.05–7.08. Tämä vaihe on ratkaisevan tärkeä Ca–DNA-kompleksin muodostumiselle.
4
steriloi liuos suodattamalla.
Fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta (PBS), ilman kalsiumia ja magnesiumia (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, new YORK)
CaCl2 (2,5 M)
Tiedotusvälineille
Normaali medium: Valmistettu ei-lämpö-inaktivoitu FCS ja keskisuurten fenolin kanssa red
Steroidi-köyhdytettyä medium: Valmistettu hiili-riisuttu FCS ja keskisuurten ilman fenoli punainen. Tätä väliainetta käytetään vain silloin, kun seerumin normaalisti sisältämien hormonien vaikutus on tarkoitus testata.,
verensiirtoa kohti käytetyn plasmidin määrä
Reporter plasmid construct, 6, 5 µg
Ekspressiovektori, 1, 0 µg
Ekspressioplasmid transfektiotehokkuuden kontrollina, 0, 5 µg
kun DNA: n kokonaismäärä on alle 8–10 µg, carrier DNA (plasmid tai silakan siittiö DNA) on lisättävä, jotta saadaan hyvä Ca-DNA-saostuma
Lysis puskuri