Holzkohle-stripped fetal calf serum (siehe auch Ref. 3)
1
250 mg Holzkohle und 25 mg Dextran T-70 zu 100 ml fetalem Kalbsserum (FCS) geben.
2
30 min bei 56°C inkubieren.
3
Zentrifuge bei 3000-4000 U / min für 30 min bei Raumtemperatur.
4
Den Überstand in frische Eimer geben.
5
Vorherige Schritte wiederholen.
6
Filtern Sie den Überstand durch einen Vorfilter (Typ AP; Millipore, Bedford, MA), um Holzkohle zu entfernen.
7
Filtern Sie die Lösung durch eine 0.,45-μ m Porengrößenfilter (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
Aliquots bei -20°C lagern
Gelatine (10 × Lager)
1
1% ige (w/v) Gelatinelösung (G-2500; Sigma, St. Louis, MO)
2
Autoklav 20 min.
3
Bei 4°C lagern
Gelatinebeschichtetes Geschirr / Flaschen
1
Den Gelatinebestand 10 mal verdünnen.
2
Pipette diese Lösung auf das Geschirr, um die Oberfläche der Schale vollständig zu bedecken (1,5 bis 2 ml pro 6-cm-Schale).
3
Lassen Sie das Geschirr 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Um diesen Vorgang zu beschleunigen, können sie 1 Stunde lang bei 37°C in den Inkubator gestellt werden.,
4
Das Geschirr absaugen.
5
Wickeln Sie das Geschirr in Aluminiumfolie und lagern Sie es bei Raumtemperatur oder bei 4°C.
HEBS Puffer (10× Stock)
1 2
Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser zu 975 ml hinzu.
3
Stellen Sie den pH-Wert auf 7,05 und das Volumen auf 1000 ml ein.
4
Autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei 4°C.
5
Vor der Verwendung wird gefilterte Glucoselösung in den Puffer gegeben (siehe Herstellung von 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
Die HEBS 10× stock fünfmal mit sterilem H2O verdünnen.
2
0,2 ml einer gefilterten Glucoselösung (1 g/ml) pro 100 ml (Endkonzentration, 10 mM) zugeben.,
3
Stellen Sie den pH–Wert auf 7,05-7,08 ein. Dieser Schritt ist entscheidend für die Bildung des Ca–DNA-Komplexes.
4
Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtration.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Medien
Normales Medium: Hergestellt mit nicht hitzeinaktiviertem FCS und Medium mit Phenolrot
Steroidabbauendes Medium: Hergestellt mit FCS mit Kohlestreifen und Medium ohne Phenolrot. Dieses Medium wird nur verwendet, wenn die Wirkung von Hormonen, die normalerweise im Serum vorhanden sind, getestet werden soll.,
Menge des pro Transfektion verwendeten Plasmids
Reporterplasmidkonstrukt, 6,5 µg
Expressionsvektor, 1,0 µg
Expressionsplasmid als Kontrolle der Transfektionseffizienz, 0,5 µg
Wenn die Gesamtmenge an DNA weniger als 8 bis 10 µg beträgt, sollte Träger–DNA (Plasmid-oder Heringsperma-DNA) hinzugefügt werden, um einen guten Ca-DNA-Niederschlag zu erhalten
Lysepuffer
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