1 Introduktion
Integralmembranproteiner utgör en stor del av genomerna hos många organismer—cirka 25% av det mänskliga genomet-och utför ett varierat utbud av funktioner, inklusive viktiga steg i kommunikationen av en cell med sin miljö., På grund av sin biologiska och terapeutiska betydelse (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009) är membranproteiner fokus för grundläggande och tillämpad biofysisk forskning för att karakterisera tredimensionella strukturer, dynamik och interaktioner i infödda miljöer.,
Solution-state NMR-spektroskopi har spelat en kritisk roll i membranproteinbiofysiska studier, eftersom den platsspecifika dynamiska och interaktionsinformationen som tillhandahålls av sådana tillvägagångssätt kompletterar strukturella data som erhållits från röntgendiffraktion, cryo-EM och beräkningsanalyser (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Grundläggande för sådana studier finns flera 2D ”fingeravtryck spectra,” oftast 15N/1H HSQC (heteronuclear enda quantum samstämmighet) spectra (för ryggraden amid plus Trp, Asn, och Gln sidechains) eller metyl-13C/1H HMQC (heteronuclear flera quantum samstämmighet) spektra för sidechain metylgrupper (Pellecchia et al., 2008). Dessa metylstyrda experiment är särskilt fördelaktiga för stora, långsamt tumlande membranprotein / lipidkomplex; experiment riktade till andra sidechain-och mainchain-platser har också tillämpats framgångsrikt., NMR–experiment kan ge information om proteindynamik under många tidsskalor, från snabba (ps-ns) sidechain-rörelser till långsamma konformationsförändringar (µs–ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Wand, Moorman, & Harpole, 2013)., Många av dessa dynamikexperiment, som ofta använder sidechain-metylgrupper som sonder, har anpassats och utvecklats för stora biomolekylära system och kan användas för membranproteiner (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
en särskild fördel med lösning-state NMR är att proteiner studeras i ett native-liknande lösningstillstånd där de kan interconvert bland flera konformationer., Membranproteiner måste emellertid solubiliseras i en lämplig membranmimetik som upprätthåller infödd struktur och dynamik. Olika alternativ inkluderar tvättmedel miceller, amphipoler, bicelles, nanodiscs, SMALPs och lipid vesiklar, var och en har sina egna fördelar och nackdelar (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Det är ofta nödvändigt att testa olika lösningsstrategier för ett givet proteinprov för stabilitet, signalintensitet och upplösning och nativ struktur/aktivitet., Två viktiga överväganden för alla membranmimetika är (1) en enhetlig och liten partikelstorlek och (2) en hög grad av deuteration.
högnivådeuteration, både inom membranmimetiken och själva proteinet, är kritisk för att minska antalet 1H-signaler som finns i spektra (inklusive de från lipider, som kan vara intensiva) och för att förbättra avslappningsegenskaperna hos de återstående NMR-aktiva spinnen i provet., Medan deuteration är möjlig för membranmimetiken genom inköp / syntes av deutererade föreningar, kräver ersättning 1H med 2H i proteiner biosyntetisk inkorporering. För ryggradsexperiment i eukaryotiska uttryckssystem kan man märka jämnt med 15N för att observera alla amider (Eddy et al., År 2018. Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) eller genom tillsats av speciellt märkta aminosyror (Isogai et al., 2016)., För metylgrupper kan man tillhandahålla antingen lämpligt märkta aminosyror eller aminosyraprekursorer (särskilt alfa-keto-syror) till Tillväxtmedier för att få tillgång till olika märkningsmönster i sidkedjorna av flera aminosyror (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucin δ1 metylgrupper särskilt bra eftersom (1) det överflöd av Ile rester i integrala membranproteiner bland annat g-proteinkopplade receptorer (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) långt upfield 13C förskjutning av isoleucin δ1 metylgrupper , sätta dem i ett särskilt trängsel regionen 2D-13C/1H spektra, (3) avsaknaden av behovet av att stereospecifically tilldela dessa metyl-grupper, till skillnad från Val och Leu, och (4) förekomsten av flera, fritt roterbara bindningar mellan metyl-grupp och protein ryggraden, vilket ger ett betydande oberoende av dynamiken på dessa platser (Kasinath et al.,, 2013).
medan många av de ovan nämnda märkningsstrategierna har utvecklats väl för E. coli, kan många integrerade membranproteiner endast uttryckas vid höga nivåer hos eukaryota värdar. Bland dessa är den metylotrofa jästen Pichia pastoris en bekväm värd för heterologt uttryck och isotopmärkning av eukaryotiska membranproteiner (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Fördelarna med Pichia inkluderar snabbhet av genetisk manipulation, hög avkastning av rekombinant protein, förekomsten av posttranslationell modifiering (RF) och förkläde maskiner som är nödvändiga för eukaryot membranproteiner, och förmåga att växa på definierade minimal medier möjliggör perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Enhetlig isotopmärkning i Pichia har varit väletablerad (Morgan et al., 2000; Pickford & lind, 2004)., Vi har utökat detta arbete genom att demonstrera 13C, 1H-märkningen av isoleucin δ1-metylgrupper i en perdeuterad bakgrund genom att lägga till märkt α-ketobutyrat (~50% märkning, ~ 90% deuteration)till högdeuterade Tillväxtmedier (Clark et al., 2017, 2015). Däremot är samtidig märkning av leucin δ-och valin γ-metylgrupper med α-ketoisovalerat ineffektiv men kan uppnås genom tillsats av märkt valin direkt till tillväxtmediet eller modifierande odlingsförhållanden (Clark et al. År 2015; Suzuki et al., 2018, Zhang et al., 2017)., Pichia kan lätt ta upp ytterligare aminosyror från media, med en allmän korrelation mellan upptagningseffektivitet och den energiska kostnaden för att syntetisera den aminosyratypen de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Efter upptag i celler kan emellertid märkta aminosyror matas in i metaboliska vägar (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & szyperski, 2004), utspädningssignal av önskade aminosyror och komplicerar dataanalys genom isotop scrambling., Alternativt kan auxotrofa stammar utvecklas för märkning av en specifik aminosyra; man måste dock vara försiktig för att bekräfta att off-target-effekter i andra metaboliska vägar inte uppstår (Whittaker, 2007).
här tillhandahåller vi detaljerade protokoll som behövs för att generera en sådan U-2H (13C, 1H-Ile δ1 metyl)-märkt integralmembranproteiner genom överexpression i Pichia, med hjälp av den mänskliga adenosin A2A-receptorn som ett modellsystem., Vi beskriver vidare hur sådana prover kan användas i lösningsstudier, från att förvärva enkla 13C / 1H HMQC spectra, genom kemiska skiftuppdrag genom platsstyrd mutagenes, till analyser av 1H-1H Cross-relaxationsmätningar av snabb sidechain dynamik.