Genetiskt encodable bioluminescent system från svampar

• bioluminescens
• svamp luciferin biosyntes
• svamp luciferas

bioluminescens är ett naturligt fenomen av ljusutsläpp som härrör från oxidation av ett substrat, luciferin, katalyseras av ett enzym, luciferas. En mängd olika arter är bioluminescent i naturen (1); för många av dem är förmågan att avge ljus ett avgörande inslag i deras biologi (2 -4). Artificiell integration av naturliga bioluminescent reaktioner i levande system har också blivit ett rapporteringsverktyg som ofta används i molekylär och cellbiologi (5, 6)., Naturliga bioluminescenssystem är emellertid dåligt karaktäriserade på biokemisk nivå, vilket begränsar mer utbredd tillämpning. Endast 9 luciferiner och 7 luciferase genfamiljer har beskrivits (7, 8) av minst 40 bioluminiscenssystem som tros existera i naturen (9). Beklagligt nog har endast en enda biokemisk kaskad som börjar från en utbredd metabolit till en luciferin beskrivits i sin helhet (10). Den beskrivna vägen är bakteriell och har begränsad tillämpning i eukaryoter (11)., Inget av de eukaryota bioluminiscenssystemen har beskrivits i tillräcklig detalj för att kunna uttryckas i en annan organism eller för att skapa artificiellt autonomt bioluminiscerande organismer. Här beskriver vi funktionen och utvecklingen av de viktigaste generna som är ansvariga för bioluminescens av svampen Neonothopanus nambi och visar att uttryck av svampgener är tillräckligt för att konstruera autonomt bioluminescent eukaryoter.

cirka 100 svamparter från ordningen Agaricales avger ljus med samma biokemiska reaktion (12)., Även om den ekologiska rollen av deras bioluminescens inte är helt klarlagd, det finns bevis för att det kan användas av svampar för att locka sporefördelande insekter (13). Svampbioluminescens var känd för att använda minst fyra komponenter: molekylärt syre; luciferin, som nyligen identifierades som 3-hydroxyhispidin; och två tidigare obeskrivna viktiga enzymer, ett NAD (P) h-beroende hydroxylas och ett luciferas (15, 16).

för att identifiera enzymer av svampbioluminescentvägen fokuserade vi först på isolering av luciferasgenen. Genom att uttrycka N., nambi cDNA bibliotek i Pichia pastoris och besprutning agar plattor med syntetiska 3-hydroxyhispidin, vi som har identifierats och analyserats lysande jäst koloni uttrycka luciferas-genen (SI Bilaga, Fig. S1 och S13). N. nambi luciferas, nnLuz, är en 267-aa protein (SI Bilaga, Fig. S2) och har ingen beskriven homologer eller uttalad sekvens likhet med bevarade proteindomäner, som representerar en ny proteinfamilj.

gener som kodar för enzymer som syntetiserar sekundära metaboliter är ofta klustrade i svampgenom (17)., Vi hypoteser att detta kan vara fallet för enzymer av den bioluminescent kaskaden, eftersom man tror att kaskaden är bevarad bland de bioluminescerande svamparna (12). Vi letade således efter gener relaterade till luciferinbiosyntes i närheten av luciferasgenen i N. nambi genomet. Förutom N. nambi, vi också sekvenserat genomet och transcriptomes av självlysande svampar Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, och Panellus stipticus och jämfört dem med offentligt tillgängliga genomet sekvenser av självlysande och nonbioluminescent svampar (18, 19)., Vi fann att luciferasen är en medlem av ett konserverat genkluster, som innehåller minst två andra gener: h3h och hisps (Fig. 1 B och C och Data S1–S3).

H3H-genen visade sekvens likhet med 3-hydroxibensoat 6-monooxygenaser, enzymer som katalyserar oxidation av 3-hydroxibensoat med NADH och molekylärt syre. Denna reaktion är identisk med den som omvandlar hispidin till luciferin (Fig. 1A); således hypoteser vi att H3H-genkoder för hispidin-3-hydroxylas (H3H), enzymet som motsvarar det förutsagda hydroxylas (15)., Vi klonade genen från N. nambi och funnit att P. pastoris kolonier och uttrycker både nnluz och nnh3h avger ljus när de sprutas med luciferin föregångare hispidin, till skillnad från kontroll kolonier uttrycka nnluz ensam (SI Bilaga, Fig. S14 och S17)—bekräftar att nnH3H omvandlar hispidin i luciferin.

hisps gen (Fig. 1C) kodar en medlem av polyketidsyntasfamiljen, enzymer som producerar sekundära metaboliter i en mängd olika organismer över livets träd (20)., Polyketidsyntaser tillför vanligtvis malonyldelar till den växande kolkedjan; sålunda föreslog α-pyronens natur hispidin att dess Biosyntes kan utföras av en polyketidsyntas från koffeinsyra med två cykler av tillsats av malonylenheter följt av laktonisering (Fig. 1A och SI Bilaga, Fig. S3). Stora modulära polyketidsyntaser kräver posttranslationella modifieringar för deras aktivitet (21), såsom överföring av en fosfopantetheinylgrupp till en bevarad serinrester av acylbärarproteindomänen., För att testa om hisps gen kan producera luciferin föregångare i en heterologa system har vi integrerat hisps, nnluz, och nnh3h gener tillsammans med Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl metyltransferas gen npgA i arvsmassan hos P. pastoris. Vid odling i ett medium innehållande koffeinsyra, jäst uttrycker alla fyra gener avges ljus ses med blotta ögat (Fig. 3A), medan ingen signifikant ljusproduktion observerades i stammar som saknade npga-eller hisps-gener (SI-bilaga, fikon. S15 och S17)., Därför katalyserar hisps syntesen av hispidin från koffeinsyra och stänger reaktionskedjan (”koffeinsyracykeln”) från en gemensam cellulär metabolit med känd biosyntes till en eukaryotisk luciferin.

i vissa bioluminescerande arter av svampar rymmer det genomiska klustret en eller två ytterligare gener (Fig. 1C): en som tillhör cytokrom P450-familjen och den andra som tillhör familjen fumarylacetoacetat hydrolaser., Den senare (cph) kodar sannolikt ett koffeylpyruvathydrolas (Dataset S4) som är involverat i oxyluciferinåtervinning, i överensstämmelse med koffeylpyruvat, svampoxyluciferin, hydrolyseras till koffeat och pyruvat genom ett hydrolas som finns i svamprådextrakt (22).

bevarande av genklustret tyder på att, i motsats till andra grupper av bioluminescerande organismer (23), bioluminescens utvecklats i svampar endast en gång, med luz, h3h, och hisps gener som växer fram genom gendupliceringar. Rekonstruerade fylogenetiska träd för luz, h3h och hisps gener (SI Bilaga, Fig., S4–S6) och arter träd av ordning Agaricales (Fig. 2) avslöja utvecklingen av bioluminescenskaskaden i svampar. Det primära luz-enzymet i svampbioluminescenskaskaden uppstod genom en genduplicering vid basen av Agaricales följt av dubbelarbete av h3h och hisps några miljoner år senare. Intressant är att många arter i en stor klad-kodning hisps är nonbioluminescent, och hisps homologer i självlysande arter saknar två domäner, det ketoreductase och dehydratase domäner (SI Bilaga, Fig. S6)., Det är troligt att förlusten av dessa funktionella domäner i den gemensamma förfadern till bioluminescensarter gynnade produktionen av α-pyroner av förfädernas hisps, vilket eventuellt gav det sista steget för uppkomsten av bioluminescens.

genklustret fortsatte att utvecklas dynamiskt efter förvärvet av bioluminescens. Minst sex oberoende fullständiga eller partiella genförlusthändelser av gener från det genomiska klustret ledde till sekundär förlust av bioluminescens (Fig. 2). Cph-genen sattes in i klustret i nonmycenoid clade, eventuellt två gånger (Fig. 1)., Detta mosaikmönster liknar evolutionär historia av fluorescerande proteiner (24), en annan visuellt relevant proteinfamilj med en otydlig biologisk roll, och kan indikera att selektiv fördel som tillhandahålls av bioluminescens hos svampar beror på ett specifikt eller övergående ekologiskt sammanhang.

komplexa anpassningar kan vara en källa till biotekniskt relevanta lösningar., Förutom att avslöja arten av grundläggande fotokemiska processer och proteinutveckling är luciferaser bland de primära typerna av reportergener som används i olika forskningsrörledningar, metoder för diagnostik och miljötillämpningar (5, 6, 25). För att avgöra om en svampbioluminiscerande väg kan ge reportergener, karakteriserade vi nnLuz in vitro och testade dess förmåga att producera ljus i heterologa system.

nnluz-proteinet består av 267 aminosyror och har molekylmassan på ca 28,5 kDa (SI-bilaga, Fig. S7)., Även om dess cellulära lokalisering in vivo fortfarande är okänd, har proteinet en förutsagd N-terminal transmembrane helix, i överensstämmelse med kolocalization av luciferasaktivitet med olösliga cellfraktioner i tidigare studier (22). När det uttrycks i P. pastoris var nnLuz associerad med den mikrosomala fraktionen (SI-bilaga, Fig. S8) och avger grönt ljus med ett maximum vid 520 nm och spektrum som är identiskt med N. nambi mycelium (Fig. 3a och Si-tillägg, Fig. S9). Rekombinant nnLuz avger ljus optimalt vid pH 8.,0 och måttliga temperaturer, förlorar sin aktivitet vid temperaturer över 30 ° C (Si bilaga, Fig. S10).

för att testa nnluz potential som reportergen i heterologa system testade vi dess uttryck i Escherichia coli, P. pastoris, tidiga Xenopus laevis-embryon och mänskliga celler., Även om luciferase ackumuleras mestadels i inklusionsorgan när de uttrycks i bakterier (SI bilaga, Fig. S7), alla testade celler och organismer som uttryckte vildtyp nnluz var tydligt bioluminescent när 3-hydroxyhispidin tillsattes till mediet (Fig. 3 och Si tillägg, fikon. S11 och S22). Vi jämförde också nnluz kvalitativt med luciferasen från firefly Photinus pyralis i en helkroppsbildningsinställning av tumör xenograft hos möss. Vi s. c., implanterade lika stora mängder av murina kolon karcinomceller som uttrycker antingen nnluz eller firefly luciferase under samma promotor, injicerade en blandning av firefly och svamp luciferiner i. P., och erhöll nästan identiska signaler från implantaten (Fig. 3C).

slutligen syftade vi till att testa om luciferinbiosyntes kan uppnås i organismer som saknar koffeinsyrabiosyntes. Införande av ytterligare tre gener som kodar för enzymer av koffeinsyrabiosyntes från tyrosin, Rhodobacter capsulatus tyrosin ammoniak lyas och två E., coli-4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase komponenter (26), i arvsmassan hos P. pastoris stam bär npgA, hisps, h3h och luz gener resulterade i en stam som var självständigt självlysande när den odlas i en vanlig jäst medium (SI Bilaga, Fig. S12 och S16).

under alla testade förhållanden är wild-type N. nambi luciferase funktionellt i heterologa system, positionerar sig som en lovande reporter-gen och svampluciferin kan syntetiseras från aromatiska aminosyror i andra eukaryoter., Dessutom är svamp luciferin en vattenlöslig och cellgenomsläpplig förening, och dess ljusavgivande reaktion är inte beroende av tillgången på ATP, vilket gör svampbioluminiscenssystemet attraktivt för många applikationer i biomedicinsk bildbehandling. Dessutom kan olika luciferinanaloger användas för att förbättra ljusutsläpp och ställa in dess spektra, vilket förbättrar ljuspenetrationen i djupvävnadsbildningsapplikationer (22).

Sammanfattningsvis presenterar vi den enzymatiska kaskaden som leder till ljusutsläpp i svampar, vilket är ett eukaryotiskt bioluminescenssystem med känd biosyntes av luciferin., Vi har visat att luciferin syntetiseras från sin föregångare hispidin av N. nambi H3H och att hispidin kan syntetiseras direkt av hispidinsyntas från koffeinsyra, en utbredd cellulär metabolit med effektiv biosyntes som uppnåddes i olika organismer, inklusive industriellt relevanta jäststammar (26)., Bara två enzymatiska steg från de vanliga metaboliska vägarna har svampsystemet en hög potential för syntetisk biologi för att skapa autonomt glödande djur och växter: försök att utveckla sådana organismer har hittills begränsats av den dåliga prestationen i eukaryoter av bakteriebioluminiscenssystemet, det enda systemet för vilket luciferinbiosyntes var känt (27, 28).

rekonstituering av svampbioluminiscentvägen i eukaryota organismer kan möjliggöra tillämpningar där vävnader eller organismer rapporterar förändringar i deras fysiologiska tillstånd med autonom ljusutsläpp., Det kan också driva på utvecklingen av nästa generation av organisk arkitektur (29), där genetiskt modifierade glödande växter kommer att integreras i byggnader och stadsinfrastruktur. Bortsett från det, med sin spännande evolutionära historia, en familj av luciferaser och övergripande enkelhet, är svampbioluminiscenssystemet som presenteras här en molekylär lekplats med många möjligheter till grundläggande och tillämpad forskning.,