Träkol-strippad fetalt kalvserum (se även Ref. 3)
1
tillsätt 250 mg kol och 25 mg Dextran t-70 till 100 ml fetalt kalvserum (FCS).
2
Inkubera vid 56°C i 30 min.
3
Centrifugera vid 3000-4000 rpm under 30 minuter vid rumstemperatur.
4
överför supernatanten till färska hinkar.
5
upprepa tidigare steg.
6
filtrera supernatanten genom ett förfilter (typ AP; Millipore, Bedford, MA)för att avlägsna kol.
7
filtrera lösningen genom en 0.,45-μ m porstorlek filter (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
lagra alikvoter vid -20 ° C.
Gelatin (10 × lager)
1
Gör en 1% (w/v) lösning av gelatin (g-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
autoklav för 20 min.
3
Förvara vid 4°C.
Gelatinbelagda rätter/flaskor
1
späd gelatinbeståndet 10 gånger.
2
pipett denna lösning på disken för att täcka ytan av skålen helt (1,5 till 2 ml per 6 cm skålen).
3
lämna disken i 2 timmar vid rumstemperatur. För att påskynda denna procedur kan de placeras i inkubatorn vid 37°C under 1 timme.,
4
aspirera disken.
5
Vik disken i aluminiumfolie och förvara dem vid rumstemperatur eller vid 4°C.
HEBS buffert (10× lager)
1 2
tillsätt dubbeldestillerat vatten till 975 ml.
3
justera pH till 7.05 och volymen till 1000 ml.
4
autoklav lösningen och förvara den vid 4°C.
5
före användning tillsätts filtrerad glukoslösning till bufferten (se beredning av 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
späd HEBS 10× lager fem gånger med steril H2O.
2
Tillsätt 0,2 ml av en filtrerad glukoslösning (1 g/ml) per 100 ml (slutlig koncentration, 10 mM).,
3
justera pH till 7.05–7.08. Detta steg är avgörande för bildandet av ca–DNA-komplexet.
4
sterilisera lösningen genom filtrering.
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium (14200-067 m; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 m)
Media
normalt medium: beredd med icke-värmeinaktiverade FCS och medium med fenolrött
Steroid-utarmat medium: beredd med kol-avskalade FCS och medium utan fenolrött. Detta medium används endast när effekten av hormoner, som normalt finns i serum, ska testas.,
mängd plasmid som används per transfektion
Reporter plasmid construct, 6.5 µg
Expression vector, 1.0 µg
Expression plasmid som en kontroll för transfektionseffektivitet, 0.5 µg
När den totala mängden DNA är mindre än 8 till 10 µg, bärar–DNA (plasmid eller sillsperma-DNA) bör tillsättas för att få en bra ca-DNA-fällning
Lysbuffert