… baserat BactoScan FC, som använder ethidiumbromid för att fläcka bakterier i mjölk, ger ett resultat efter 8 min (5, 30). En flödescytometrisk teknik för mätning av TBC i rå och ultrahög temperaturmjölk med fläcken SYTO BC har också beskrivits tidigare (16). Dessa tekniker är emellertid antingen mycket specifika, detekterar endast en art eller ospecifik, detekterar alla bakterier., Flödescytometriska tekniker för differentiering av bakterier i mjölk i större grupper, såsom grampositiva och gramnegativa bakterier, har ännu inte beskrivits. Gramfärgning beskrevs ursprungligen 1883 av Christian grams kollega Carl Friedlander, som delade bakterier i två grupper och igen 1884 av Christian Gram (12, 14). Det konventionella Gram-färgningsproceduren innefattar fläckarna kristallviolett och safranin. Värmefasta celler på en glid är färgade blåviolett med kristallviolett, och därefter behandlas de med etanol., Gramnegativa bakterier avkoloriseras av etanol, medan grampositiva bakterier förblir färgade med kristallviolett. Härefter används safranin för att motverkasfläta gramnegativa bakterier, vilket ger denna grupp ett rosa utseende. Många alternativa metoder för att identifiera Gramreaktionen har rapporterats. En metod där en koloni av bakterier utsätts för 3% kaliumhydroxid används i stor utsträckning. Den höga koncentrationen av kaliumhydroxid lyser gramnegativa bakterier, frigör DNA från cellerna, vilket kan bekräftas genom att dra en viskös sträng från kolonin (15, 26)., En alternativ Gramfärgningsteknik med fluoresceinkonjugerad lektin vetegroddar agglutinin (WGA) för kombinerad epifluorescens och ett faskontrastmikroskop har beskrivits (29). WGA binder till N-acetylglukosamin i cellväggens Pep-tidoglykanskikt. Gramnegativa bakterier har ett lager av lipopolysackarid som täcker cellväggen och det är därför de inte färgas med WGA, medan grampositiva bakterier färgas med WGA, eftersom de inte har ett lipopolysackaridskikt., Dessa resultat visade en okänslighet för Odlingens ålder vilket innebar att denna fläck kunde användas direkt på prover utan att provet prekultiverades. En modi Fi ed-version av WGA-tekniken har beskrivits för bakterier som finns i en icke-livsmedelsmiljö där bakterierna immobiliseras på ett lter, tvättas och sedan färgas med WGA (11). Vissa Gramfärgning tekniker för fl ow cytometri har också föreslagits. Man använder fl uorescerande lipofila fläck rho – damine 123, som selektivt fläckar gram-positiva bakterier., Lipopolysackaridskiktet av gramnegativa bakterier förhindrar införandet av rhodamin 123 (1, 28). En annan liknande teknik som kombinerar de två fl uorescerande DNA-bindande fläckar, SYTO 13 och hexidium jodid (HI). SYTO 13 är en membranpermeabel fläck, och HI blockeras av lipopolysackaridskiktet av gramnegativa bakterier och därmed endast permeabel till grampositiva bakterier och gramnegativa bakterier med ett avstabiliserat lipopolysackaridskikt (22). Men på grund av den bräckliga naturen hos lipopolysackaridskiktet tros dessa tekniker inte vara lämpliga för okultiverade prover., Syftet med det nuvarande arbetet har varit att utveckla en Gram-färgningsteknik baserad på färgning av bakterier med WGA och HI och följt av fl ow cytometrisk detektion. Tekniken utvärderades på mjölkrelaterade bakterier (19, 20) i sta-tionsfasen och efter 6, 12 och 48 timmar av inkubation i Labo-ratorisk media. Dessutom testades metoden på stations-ary-fas-kulturer som hade lagrats i 24 timmar vid 18 ° C och i 14 dagar vid 5 ° C. slutligen applicerades tekniken på bulktankmjölk spikad med kända bakterier., En teknik för differentiering av grampositiva och gramnegativa bakterier i bulk Tank mjölk utan prekultivation kommer att vara den ultimata ap-pliceringen. Figur 1 visar effekten av KCl-koncentrationen på bindningen av WGA till de gram-positiva bakterierna M. luteus och S. uberis , när bakterierna färgas av WGA ensam, exklusive HI. I histogrammen ses bruset till vänster, där händelser med låga fl uorescensintensiteter har ackumulerats (en thresh – old användes för att skära bort det mesta av bullret)., När bakterier färgas tillräckligt för att skilja dem från buller, kommer de att visas som en topp helt skild från buller. Med 0 m KCl färgades ingen av de två bakterierna tillräckligt för att skilja dem från bullret. Med 1 m KCl observerades en ökad fl – uo-cens-intensitet för båda bakterierna. M. luteus separerades sedan från bullret, och S. uberis bara något överspänt bullret. Att öka KCl-koncentrationen till 3 m förbättrade ytterligare bindningen (högre fl uorescensintensiteter) av WGA till dessa bakteriestammar, särskilt för M. luteus ., Mikroskopiska observationer visade att grampositiva bakterier färgades av WGA, medan gramnegativa bacte-ria inte färgades av WGA. HI färgade både gram-positiva och gram-negativa bakterier. Figur 2 visar ett exempel på färgning av en blandning (1:1) av den grampositiva M. luteus och den gramnegativa E. coli med både WGA och HI. Som ett resultat av färgningen uppträdde M. luteus med en grön yta (WGA) och en röd cytoplasma (HI), medan E. coli endast uppträdde med en röd cytoplasma. Isometriska tomter av cyto – metriska analyser av kulturer av E. coli, M., luteus och en blandning (1:1) av dessa visas i Fig. 3. Mätning av E. coli ensam (Fig. 3A), 100% av händelserna var närvarande i den gramnegativa regionen. För M. luteus ensam (Fig. 3b), 99% av händelserna var i den grampositiva regionen och 1% av händelserna gick in i den gramnegativa regionen. När kulturer av E. coli och M. luteus blandades (Fig. 3C), 50% av händelserna observerades i varje region. Var och en av de 12 bakteriestammarna mättes i två exemplar efter 6,12, 24 och 48 h inkubation. Från varje mätning användes 100 händelser för beräkningar. I Fig., 4 en sammansatt tomt presenteras som omfattar alla 800 händelser för var och en av de 12 bakteriestammar som testats under 48 timmar av inkubation (totalt 9 600 händelser). Varje bakteriell stam presenteras med en distinkt färg. En beräknad bästa linje för att separera gram-positiva och gram-negativa bakterier visas. Sammantaget säkerställde linjen att 97% av händelserna skulle tolkas korrekt. Procentandelarna av celler som tolkats korrekt för de enskilda stammarna beräknades och presenteras i Tabell 1. För E. cloacae , E. coli , K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae , S., dys-galactiae och S. uberis, nästan alla celler ( 96%) tolkades korrekt för någon inkubationstid. För B. cereus , P. fl uores – cens och P. putida tolkades 93% av cellerna korrekt efter 12 och 24 timmar av inkubation, medan efter 6 och 48 timmar av inkubation tolkades endast 75-89% av cellerna korrekt. I Tabell 2 presenteras resultaten från fl ow-cytometriska analyser av kulturer som utsatts för olika lagringsförhållanden., När kulturerna lagrades vid 5 ° C i 14 dagar tycktes färgningstekniken vara inhägnad av kulturens ålder, särskilt för gramnegativa bakterier. Den genomsnittliga andelen korrekt tolkade celler var 86%. För E. coli tolkades M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae och S. uberis , de flesta celler ( 97%) korrekt. För B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis och S. aureus tolkades 76-89% korrekt , och för P. fl uorescens och P. putida var fi-värdena 58 respektive 68%., Frysning verkade inte i fläns fläcken teknik. Efter lagring på Ϫ 18 ° C under 24 h, Ͼ 98% av cellerna var att tolkas korrekt för E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , och S. uberis . För B. cereus och P. fl uorescens var fi-värdena 83 respektive 82%. Figur 5 visar de isometriska tomterna av fl ow-cytometriska Anal – yses av S. aureus och E. coli tillsatt till bulktankmjölk. För S. aureus (Fig. 5a), 98% av händelserna var i den grampositiva regionen och 2% av händelserna gick in i den gramnegativa regionen., För E. coli (Fig. 5b), 96% av händelserna var i den gramnegativa regionen och 4% av händelserna gick in i den gram-positiva regionen. Bidraget från de naturliga bakterierna i mjölken stod för mindre än 0,1%. Tillsatsen av en hög koncentration av KCl till färgningslösningen förbättrade WGA: s förmåga att färga gram-positiva bakterier. En möjlig förklaring är att grampositiva bakterier har teichoesyror fästa vinkelrätt mot sina cellväggar, vilket för vissa gram-positiva bakterier kan blockera WGA-åtkomst till cellväggen., När koncentrationen av KCl är låg är strukturen hos teichoesyrorna styv, men genom att öka koncentrationen av KCl, kommer strukturen att lossas eftersom kaliumjonerna eliminerar de negativa laddningarna på teichoesyrorna, vilket gör att strukturen kollapsar (8, 9). Sammansättning och struktur av teichoic fettsyror varierar mellan gram-positiva arter (24), vilket kan förklara varför en ökning i koncentration KCl från 1 till 3 M hade en större effekt på M. luteus än på S. uberis . I det nuvarande arbetet användes 3 m KCl för att maximera bindningen av WGA till gram-positiva bakterier., Tekniker för eliminering av organisationen av teichoesyrorna har tidigare rapporterats endast för mikroskopiska applikationer. Dessa tekniker innefattar användning av osmiumtetroxidförlängning genom acetontillsättning och avdunstning (2) och värmebehandling av bakterier på en mikroskopisk bild (29). Dessa behandlingar kunde emellertid inte beaktas i den nuvarande studien, eftersom ett dehydreringssteg inte är lämpligt för fl ow-cytometri., Gramfärgningstekniken visade tillförlitliga resultat för alla stammar efter 6, 12, 24 och 48 h inkubation, för vilka nästan alla (97%) celler tolkades korrekt. Dessa resultat överensstämmer med resultaten av WGA-Gram-färgningsmetoden som återporterats …