Antagonism mellan penicillin och erytromycin mot Streptococcus pneumoniae in vitro och in vivo

Abstrakt

kombinationen av β-laktamantibiotika och makrolider rekommenderas ofta för initial empirisk behandling av akut lunginflammation för att erhålla aktivitet mot de viktigaste patogenerna. Teoretiskt kan denna kombination vara olämplig, eftersom det bakteriostatiska medlet kan motverka effekten av det bakteriedödande medlet., I denna studie undersöktes den möjliga interaktionen mellan penicillin och erytromycin in vitro och in vivo mot fyra kliniska isolat av Streptococcus pneumoniae med Mic av penicillin från 0, 016 till 0, 5 mg/l och av erytromycin från 0, 25 till >128 mg/L. in vitro–tiddödningskurvor genererades med kliniskt relevanta koncentrationer av penicillin (10 mg/L) och erytromycin (1 mg/L), antingen individuellt eller i kombination. Antagonism mellan penicillin och erytromycin observerades för de fyra isolaten., Interaktionen in vivo undersöktes i musens peritonitmodell. Efter intraperitoneal ympning gavs penicillin och erytromycin antingen individuellt eller i kombination. För två av de fyra isolaten var dödligheten signifikant högre i de grupper som behandlades med kombinationen av penicillin och erytromycin än i grupperna som behandlades med enbart penicillin . Med hjälp av musens peritonitmodell visade in vivo time–kill-kurvor att det fanns antagonism mellan erytromycin och penicillin för det undersökta isolatet., Antagonismen visade in vitro och in vivo mellan penicillin och erytromycin tyder på att β-laktamantibiotika och makrolider inte ska administreras tillsammans om inte pneumokockinfektion utesluts.

introduktion

det är en utmaning att välja rätt behandling för patienter med lunginflammation, eftersom etiologin inte kan förutsägas baserat på enbart symtom och kliniska fynd, och en slutlig mikrobiologisk diagnos har vanligtvis inte fastställts innan behandlingen måste påbörjas., Streptococcus pneumoniae är den vanligaste isolerade organismen i samhällsförvärvad lunginflammation, särskilt hos små barn och äldre patienter, och infektionen bär fortfarande en hög dödlighet.1 Men infektion med Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae och Legionella spp. är också vanliga2, 3 och dessa organismer är vanligtvis inte känsliga för de antimikrobiella medel som vanligen används för behandling av pneumokocker. Därför rekommenderas penicillin eller andra β-laktamer ofta i kombination med erytromycin för initial empirisk behandling av akut lunginflammation av okänd etiologi.,Tidigare har in vitro och in vivo synergier mellan β-laktamantibiotika, såsom penicillin, ampicillin, piperacillin och cefuroxim, visats i kombination med gentamicin mot S. pneumoniae.5, 6 Antagonism in vitro har visats för kombinationer såsom ampicillin och kloramfenikol mot Haemophilus influenzae7 och mot grupp B streptokocker.,8 kliniskt viktig antagonism har rapporterats mellan penicillin och tetracyklin mot pneumokocker, 9, 10 penicillin och erytromycin mot grupp A streptokock11 och ampicillin, streptomycin och kloramfenikol vid akut bakteriell meningit.12 teoretiskt empirisk initial behandling av lunginflammation med en kombination av p-laktam och makrolid kan också vara olämpligt i fallet med pneumokockinfektion, eftersom bakteriostatisk makrolid kan motverka bakteriedödande verkan av β-laktam.,

i denna studie undersökte vi den möjliga interaktionen mellan penicillin och erytromycin in vitro mot fyra kliniska isolat av pneumokocker med olika känslighet för penicillin och erytromycin.6,13 vi studerade interaktioner in vivo i mus peritonit modell.6

material och metoder

bakterier, media och tillväxtförhållanden för musperitonitmodellen

Bakteriesuspensioner som ska användas som inokula för in vitro-och in vivo-tester framställdes från färska övernattningskulturer på 5% blodagarplattor tillverkade av frysta stamkulturer., Inokulatet för musförsök bereddes omedelbart före ympning genom att suspendera kolonierna i steril Mueller-Hintonbuljong (Statens Serum Institut, Köpenhamn, Danmark) och justerades till en optisk densitet vid 540 nm på 0,5–1,0, vilket gav en koncentration av C. 108 cfu/mL, såsom beskrivits tidigare.13 för varje experiment bestämdes inokulatets storlek efter att ha gjort 10-faldiga utspädningar i Mueller-Hintonbuljong, av vilka 20 µL pläterades på två 5% blodagarplattor i fläckar i duplikat, med efterföljande räkning av kolonier efter inkubation över natten vid 35 ° C i luft., Mucin (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), ett enzymextrakt av svinmage, användes som ett adjuvans för ympning av mössen och framställdes som en stamlösning 10% (w/v) i saltlösning.13 omedelbart före ympning späddes mucinlösningarna 1: 1 med pneumokocksuspensioner, vilket gav en slutlig mucinkoncentration på 5% (w/v).

de använda läkemedlen var penicillin G (Leo Pharmaceutical Co., Ballerup, Danmark) och erytromycin (Sigma Chemical Co.). Penicillin G späddes i fosfatbuffrad saltlösning pH 6,5 ± 0.,1 och erytromycin späddes i 9 mL sterilt vatten och 1 mL 96% alkohol; erytromycinlösningens pH justerades till mellan 6, 7 och 7, 3.

Mikrofoner och mikrofoner

Mikrofoner bestämdes genom buljongmakrodilueringsmetoden i glasrör. Alla tester utfördes i två exemplar och resultat lästes efter 20 h inkubation vid 35°C. buljong macrodilution metod i glasrör utfördes med Mueller–Hinton buljong (Statens Serum Institut) som 5% sheep blood var extra; en inoculum 106 cfu/mL användes., Penicillin G späddes i tvåfaldiga steg i Mueller-Hinton buljong för att ge koncentrationer av 0,004-64 mg / L. den lägsta koncentrationen av antibiotikum vid vilken det inte fanns någon synlig tillväxt togs som MIC. Vi använde S. pneumoniae ATCC 49619 som en kontrollstam för MIC-testerna.

MBC bestämdes genom subkultur av rör utan synlig tillväxt efter MIC-bestämning. Från varje rör odlades 100 µL på agarplattor innehållande penicillinas (Leo Pharmaceutical Co.) 1000 IE / platta och kolonier räknades efter inkubation under 18-24 timmar vid 35 ° C., MBC definierades som den lägsta koncentrationen av penicillin som reducerade inokulatet med ≥99, 9%. Alla analyser utfördes i två exemplar.

tid–kill–kurvor

för att studera möjliga interaktioner mellan penicillin och erytromycin utfördes tid-kill-experiment med kliniskt relevanta penicillinkoncentrationer och erytromycinkoncentrationer på 10 respektive 1 mg / l., Före time–kill-experiment odlades isolat 86 (erytromycinresistent) på 5% blodagarplattor innehållande erytromycin 4 mg/l (induktion av erytromycinresistens) och på plattor utan erytromycin (ingen induktion av erytromycinresistens). Pneumokocker (106 cfu/mL) inkuberades i 20 mL Mueller–Hintonbuljong vid 35°C med skakning. För att säkerställa exponentiell tillväxt av bakterierna tillsattes antibiotika först efter 1 h inkubation. Prover togs före tillsats av antibiotika och 1, 2, 3 och 5 h senare., Tid-kill kurvor förlängdes inte längre, eftersom autolys började inträffa efter 5-6 h för alla isolat. Antalet cfu / mL bestämdes efter lämpliga utspädningar och 100 µL spreds vidare till 5% blodagarplattor. För outspädda prov användes agarplattor innehållande penicillinas (enligt ovan). Kolonier räknades efter 20 h inkubation vid 35 ° C. all time-kill experiment utfördes i två exemplar. Variationen i kolonital vid samma tidpunkter för upprepade experiment var<0.5 log10 per mL., Antagonism definierades som en signifikant minskad dödande effekt (dvs>0.5 log10 cfu/mL från 1 till 5 h efter tillsats av läkemedel) av kombinationen av penicillin och erytromycin jämfört med enbart penicillin.14

i tidsdödningsexperimenten mätte vi möjliga pH–förändringar i kolvarna med pH-testremsor (pH-intervall 4.5-10.0; graderad i 0.5 pH-enheter; Sigma Chemical Co.).

djurförsök (modell för musperitonit)

alla djurförsök godkändes av den danska nationella etiska djurkommittén., Outbred kvinnliga ssc CF-1 möss (Statens Serum Institut) i åldern 8-12 veckor, vikt 28-30 g användes, i grupper om fem till 36 möss. Sammantaget använde vi 88-möss för isolat 73, 89-möss för isolat 75, 88-möss för isolat 86 (utan induktion), 94–möss för isolat 86 (inducerad med erytromycin som För time-kill-studier) och 89-möss för isolat 93. Mössen hölls i burar med fem till sju möss per bur; de fick fri tillgång till mat och vatten. Pneumokocksuspension (0, 5 mL) inokulerades intraperitonealt via en 25-gauge spruta., Inokulatet innehöll 106 cfu/mL med 5% (w/v) mucin i Mueller–Hintonbuljong. Med hjälp av sådan inokula finns det C. 100% dödlighet hos obehandlade möss, som succumb 36-48 h efter ympning. Antibiotika administrerades subkutant i nackområdet i en volym av 0, 25 mL per dos.Följande schema användes: erytromycin gavs 90 min efter bakteriell ympning och i kombinationsgruppen gavs erytromycin 90 min efter bakteriell ympning och penicillin 60 min senare. Penicillin gavs ensamt 150 min efter bakteriell ympning., Kontrollmöss gavs steril saltlösning 90 min efter bakteriell ympning.

doser av penicillin och erytromycin valdes enligt Hill ekvation sigmoid dos-effekt kurvor, på ett sådant sätt att penicillin enbart skulle förväntas resultera i C. 95% överlevnad, medan erytromycin enbart förväntades förhindra dödlighet i 10% av mössen. Möss infekterade med isolate 73 behandlades med penicillin 10 mg / mus och / eller erytromycin 100 µg / mus. Möss infekterade med isolate 75 behandlades med penicillin 2 mg/mus och/eller erytromycin 100 µg / mus., Möss infekterade med isolat 86 (ej inducerade) behandlades med penicillin 150 µg/ mus och/eller erytromycin 100 µg/mus. Möss infekterade med isolat 86 (odlade i närvaro av subhämmande koncentrationer av erytromycin före ympning) behandlades med penicillin 150 µg/mus och/eller erytromycin 100 µg/mus. Möss infekterade med isolat 93 behandlades med penicillin 400 µg / mus och / eller erytromycin 100 µg / mus.

blodprover erhölls genom orbitalskärningar efter bedövning av mössen med CO2., Möss dödades och peritoneala tvättar utfördes sedan genom att injicera 2 mL steril saltlösning intraperitonealt, massera buken och öppna bukhinnan för att samla vätskan.15 blod-och peritonealvätskeprover späddes omedelbart och 0, 1 mL pläterades på 5% blodagarplattor.

in vivo time–kill-kurvor konstruerades för en av pneumokockisolaten (nummer 93), som visade signifikant antagonism in vivo. Pneumokocker i bukhinnan och blodet erhölls efter ympning av 36 möss intraperitonealt med 5,0 × 106 cfu / mL av bakteriesuspensionen., Tio minuter, 80 min, 140 min, 3 h och 5 h efter utmaning dödades grupper av tre kontrollmöss (inokulerade med steril saltlösning). Vid 140 min, 3 h och 5 h efter utmaning dödades grupper av tre möss som behandlades med erytromycin 90 min efter utmaning. Vid 3 h och 5 h efter utmaning behandlades grupper av tre möss antingen med kombinationen av penicillin och erytromycin eller penicillin ensamt 150 min efter intraperitoneal infektion. Blod – och peritonealtvättning samplades för kvantitativ kultur av pneumokocker.,

bestämning av ED50 penicillin för individuella pneumokocker

ED50, den enda dos som ger skydd till 50% av mössen, för varje pneumokockisolat bestämdes genom att behandla grupper av fem möss med fördubbling doser av antibiotika; överlevnaden hos mössen observerades i 7 dagar. En grupp av fem möss behandlade med 0.9% NaCl inkluderades i varje experiment som en kontroll för infektionens dödlighet. För varje isolera ED50 var beräknad enligt metoden av Reed & Muench16 och från Backen ekvation (GraphPad Prism; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Vi utförde inga experiment för att beräkna erytromycin ED50s eftersom detta tidigare har gjorts för stammar med liknande Mic i vårt laboratorium.17 vi valde penicillindoser som skulle förväntas resultera i en uppskattad 95% överlevnad hos möss och erytromycindoser som skulle förväntas resultera i en uppskattad 10% överlevnad hos mössen. För kombinationsbehandling gavs antibiotika i separata injektioner.

statistik

Fishers exakta test för kategoriska data användes, med en tvåsidig 5% nivå av betydelse.,

resultat

MICs av penicillin och erytromycin och ED50-penicillin för de fyra pneumokockstammarna visas i tabellen. Dödlig infektion uppnåddes med tre av fyra isolat. ED50 av penicillin för isolate 86 måste dock uppskattas eftersom det endast var möjligt att uppnå 90% dödlighet i ED50-bestämningsexperimenten.

resultaten av time-kill-experimenten visas i Figur 1., Med denna metod visade alla isolat in vitro antagonism för kombinationen av penicillin och erytromycin (Figur 1a–C och e) eftersom erytromycin nästan helt hämmade den bakteriedödande effekten av penicillin. När erytromycinresistens inducerades genom att det erytromycinresistenta isolatet (nummer 86) odlades på blodagarplattor innehållande erytromycin 4 mg/L före time–kill-studien neutraliserades erytromycinantagonism (figur 1D).

för alla isolat ökade in vitro-dödande effekten av penicillin och penicillin plus erytromycin med tiden., Minskningen i cfu som sågs i kontrollflaskorna i vissa experiment berodde på autolys, en vanlig observation med pneumokocker. I alla experiment visade erytromycin ensam en mindre dödande effekt än penicillin och kombinationen. Ingen dödande effekt observerades under inkubationstiden på 5 timmar i den erytromycinresistenta stammen, oavsett om den inkuberades med erytromycin eller ej. Inga förändringar i pH observerades i kolvarna innehållande en eller båda antibiotika: pH var 7,5 efter 0, 1, 2, 3, 4 och 5 h inkubation.,

i musens peritonitmodell fann vi att den kombinerade behandlingen av penicillin och erytromycin resulterade i antagonism hos möss som utmanades med isolat 75 och 93 (Figur 2B och e). Det var signifikant högre dödlighet hos möss som behandlades med erytromycin 60 min före penicillin än hos möss som behandlades med enbart penicillin (isolat 75: dödlighet 32/36 respektive 3/12, P < 0,05; isolera 93: dödlighet 24/36 respektive 3/12, p < 0,05) (Figur 2)., I de återstående två isolaten var dödligheten hos möss som gavs båda antibiotika liknande den hos möss som gavs enbart penicillin (figur 2a och d). Alla kontrollmöss dog när de infekterades intraperitonealt med pneumokocker, förutom möss infekterade med isolat 86, för vilka dödligheten var 80-90%. Även när det bakteriella inokulatet av isolat 86 ökades till 108 cfu/mL var det inte 100% mortalitet.

den lägsta dödligheten hittades i de grupper av möss som behandlades med enbart penicillin eller erytromycin plus penicillin i kombination efter bakterieutmaning., Den högsta dödligheten observerades bland kontrollmöss eller möss som behandlades med enbart erytromycin 90 min efter pneumokockinfektion (Figur 2). För isolat 86 fann vi att den kombinerade behandlingen gav signifikant bättre skydd mot pneumokockinfektion än behandling med penicillin ensam efter 150 min (32/35 möss i den tidigare gruppen överlevde jämfört med 6/12 i den senare; P = 0.009) eller erytromycin ensam (32/35 och 16/36 överlevnad, respektive; p = 0.005) (figur 2C)., När erytromycinresistens inducerades före ympning med isolat 86 gav den kombinerade behandlingen signifikant bättre skydd än enbart erytromycin (31/36 möss i den tidigare gruppen överlevde jämfört med 5/36 i den senare; P = 0,005).

in vivo time–kill-kurvorna för isolate 93 visade en 1-2 log ökning av tillväxten av bakterier i blod 80 min efter utmaning jämfört med 10 min efter utmaning i kontrollmössen (Figur 3), medan antalet pneumokocker i peritoneala tvättar vid 80 min var detsamma som 10 min efter ympning., Antalet pneumokocker odlade från blod och peritoneala tvättar vid olika tidpunkter i de olika behandlingsgrupperna var nästan parallella, med 1-2 log högre cfu / mL i peritoneala tvättar än i blod. Dödandet av bakterier var mest effektivt i den penicillinbehandlade gruppen, med en minskning av bakterietillväxten av 3 stockar och 4 stockar i blod respektive peritoneala tvättar. Kombinationsbehandlingen visade en liknande effekt på bakterietillväxten som när erytromycin gavs ensamt (antagonism).,

diskussion

interaktionen mellan erytromycin och penicillin mot pneumokocker studerades med fyra isolat med olika känslighet för penicillin eller erytromycin. In vitro time-kill-kurvorna för det erytromycinkänsliga isolatet (Figur 1a, B och e) visade tydlig antagonism mellan de två läkemedlen, d.v. s. närvaron av erytromycin inhiberade fullständigt penicillins bakteriedödande aktivitet och den resulterande kurvan liknade den långsamma hämmande aktiviteten hos enbart erytromycin., Hämningen av effekten av penicillin (som är surt) kan ha bero på ökningar i pH som orsakas av erytromycin (som är alkalisk). PH-mätningar i kolvar med läkemedelskombinationen visade emellertid inga förändringar i pH. den antagonistiska effekten sågs också i det oinducerade erytromycinresistenta pneumokockisolatet (86), medan induktion av uttrycket av erytromycinresistensgenen förhindrade den hämmande effekten av erytromycin och dess antagonistiska aktivitet på penicillin., Dessa resultat indikerar tydligt att det är makrolidens hämmande aktivitet på bakteriens tillväxt eller celldelning som är den främsta orsaken till antagonism mot penicillin, vilket endast kan verka på bakterier som befinner sig i tillväxtfasen och producerar en cellvägg.15 denna bakteriostatiska aktivitet av erytromycin och dess hämmande effekt på penicillin var tydligt uppenbara i in vivo-experimenten.,

för att utvärdera den möjliga interaktionen mellan de två läkemedlen in vivo valde vi musperitonitmodellen,som tidigare har varit användbar för att demonstrera interaktion mellan antibiotika, 6 och som också gör det möjligt för en att studera läkemedelsverkan på bakterier genom att utföra tidsdödande experiment in vivo på organismer i bukhinnan och/eller blodet.17 doser av penicillin och erytromycin valdes enligt Hill ekvation sigmoid dos-effekt kurvor, på ett sådant sätt att penicillin enbart skulle förväntas resultera i c., 95% överlevnad, medan erytromycin ensam bara skulle kunna förhindra dödlighet hos 10% av mössen. Med dessa doser skulle en effekt av erytromycindosen utan påverkan av en efterföljande penicillindos resultera i en dödlighet bestämd enbart av makrolidens aktivitet. Den antagonistiska aktiviteten hos de två läkemedlen bekräftades därefter, genom tidsdödningskurvor in vivo, att bero på samma tillväxthämmande aktivitet av erytromycin Som Visats in vitro., Betydelsen av induktion av erytromycinresistens i erytromycinresistent isolat (nummer 86) visades också in vivo: induktion med erytromycin minskade signifikant överlevnaden trots erytromycinbehandling jämfört med överlevnad efter erytromycinbehandling av icke-inducerade pneumokocker.

med ett erytromycinkänsligt isolat (nummer 73) var det inte möjligt att visa antagonism in vivo med den använda metoden. Det kan finnas flera förklaringar till detta., Möjligheten att inte alla pneumokocker svarar på ett liknande sätt som de två läkemedel som används verkar osannolikt, särskilt när aktiviteten var lika påvisbar in vitro. Det är mer sannolikt att situationen in vivo är annorlunda för de olika stammarna, t. ex. virulensen hos pneumoccci beror på ett antal faktorer som är svåra att standardisera, såsom kapselns typ och storlek, andra virulensfaktorer som är kopplade till membranet eller toxinerna, eller tillväxtbeteendet in vivo, vilket är mycket varierande för pneumokocker., Det är troligt att vi kunde ha visat antagonism in vivo med isolate 73 om vi hade ”titrerat” inokulatet och tidpunkten för de två läkemedlen i förhållande till varandra, men detta skulle kräva ett alltför stort antal djur., Den tydliga demonstrationen av interaktionen mellan de två läkemedlen mot minst två pneumokockstammar både in vitro och in vivo, vilket visades av ökningen av mortaliteten såväl som av förändringarna i in vivo–tid-kill-kurvor, är gott om bevis för en effekt och bör varna kliniker mot användningen av dessa två läkemedel tillsammans för att behandla pneumokockinfektioner.

den kliniska betydelsen av antagonism mellan ett bakteriedödande läkemedel såsom penicillin eller ampicillin och en bakteriostatisk proteinsynteshämmare, t. ex., tetracyklin, erytromycin eller kloramfenikol, har visats i flera studier.7-12,18 Antagonism har bekräftats in vivo i en experimentell studie med penicillin och kloramfenikol mot pneumokockmeningit hos hundar.19 trots denna tidiga erfarenhet av sådana läkemedelskombinationer rekommenderas kombinationen av penicillin och erytromycin även i vanliga läroböcker som empirisk behandling vid lunginflammation av okänd etiologi.4 läkemedelskombinationen är särskilt vald för att omfatta pneumokocker och Legionella spp.,, som anses vara viktiga och dödliga aetiologiska medel i lunginflammation. Det är svårt att veta om resultaten av denna studie är direkt tillämpliga på den kliniska situationen. I den kliniska situationen skulle suboptimala doser av erytromycin vanligtvis inte användas, men med inhiberad verkan av penicillin kan man behöva förlita sig på den bakteriostatiska effekten av erytromycin, om pneumokocker är erytromycin mottaglig. Det är inte känt om den inducerbara effekten av erytromycin som visas i denna studie också sker i pneumoniskt fokus hos människor.,

Sammanfattningsvis har denna studie visat antagonism mellan penicillin och erytromycin mot tre erytromycinkänsliga isolat av pneumokocker in vitro. Denna antagonism inträffade också med två av isolaten in vivo i en enkel experimentell modell med möss. När erytromycinresistens inte inducerades visades också antagonism in vitro för det erytromycinresistenta pneumokockisolatet, men induktion med erytromycin före ympning utplånade den antagonistiska effekten.

expertens tekniska hjälp av Anja Borum och Jytte Mark Andersen uppskattas mycket., Preliminära uppgifter som presenterades i slutlig form i detta manuskript presenterades vid den trettiosjunde Interscience-konferensen om antimikrobiella medel och kemoterapi, Toronto, Ontario, Kanada, 28 September–1 oktober 1, 1997 (affisch a-29).