semnificația
prezentăm identificarea luciferazei și enzimelor biosintezei unei luciferine eucariote din ciuperci. Ciupercile posedă un sistem bioluminescent simplu, luciferina fiind doar două etape enzimatice din căile metabolice cunoscute. Expresia genelor din calea bioluminescentă fungică nu este toxică pentru celulele eucariote, iar luciferaza poate fi ușor cooptată în aplicații bioimagistice., Sistemul fungic fiind un sistem bioluminescent codabil genetic din eucariote, acum este posibil să se creeze eucariote bioluminescente artificial prin exprimarea a trei gene. Fungice bioluminiscente sistem reprezintă un exemplu de evoluție moleculară a unui complex ecologic trăsătură și cu moleculară detalii relatat în lucrare, va permite cercetări suplimentare în semnificație ecologică fungice bioluminiscență.,
Abstract
bioluminescența se regăsește în întregul arbore al vieții, conferind un set spectaculos de funcții orientate vizual de la atragerea partenerilor la sperierea prădătorilor. O jumătate de duzină de luciferine diferite, molecule care emit lumină atunci când sunt oxidate enzimatic, sunt cunoscute. Cu toate acestea, o singură cale biochimică pentru biosinteza luciferinei a fost descrisă în întregime, care se găsește numai în bacterii., Aici, raportăm identificarea luciferazei fungice și a altor trei enzime cheie care formează împreună ciclul biosintetic al luciferinei fungice din acidul cafeic, un metabolit simplu și răspândit. Introducerea genelor identificate în genomul drojdiei Pichia pastoris împreună cu genele de biosinteză a acidului cafeic a dus la o tulpină care este autoluminescentă în mediile standard. Am analizat evoluția enzimelor ciclului de biosinteză a luciferinei și am constatat că bioluminescența fungică a apărut printr-o serie de evenimente care au inclus două duplicări genetice independente., Păstrarea duplicat enzime de luciferină cale în nonluminescent ciuperci arată că gena de duplicare a fost urmată de o secvență funcțională divergență de enzime de cel puțin o genă în căii biosintetice și sugerează că evoluția fungice bioluminiscență a procedat prin mai multe strâns legate piatră de temelie nonluminescent reactii biochimice cu rol adaptativ. Disponibilitatea unei căi complete de biosinteză a luciferinei eucariote oferă mai multe aplicații în Biomedicină și bioinginerie.,bioluminescența este un fenomen natural de emisie de lumină care rezultă din oxidarea unui substrat, luciferina, catalizat de o enzimă, luciferaza. O varietate de specii sunt bioluminescente în natură (1); pentru multe dintre ele, capacitatea de a emite lumină este o caracteristică definitorie a biologiei lor (2⇓-4). Integrarea artificială a reacțiilor bioluminescente naturale în sistemele vii a devenit, de asemenea, un instrument de raportare utilizat pe scară largă în biologia moleculară și celulară (5, 6)., Cu toate acestea, sistemele bioluminescente naturale rămân slab caracterizate la nivel biochimic, limitând aplicarea pe scară mai largă. Au fost descrise doar 9 familii de luciferine și 7 familii de gene luciferază (7, 8) din cel puțin 40 de sisteme bioluminescente despre care se crede că există în natură (9). Lamentabil, numai o singură cascadă biochimică pornind de la un metabolit răspândit la o luciferină a fost descrisă în întregime (10). Calea descrisă este bacteriană și are o aplicare limitată în eucariote (11)., Niciunul dintre sistemele bioluminescente eucariote nu a fost descris suficient de detaliat pentru a fi exprimat într-un alt organism sau pentru a crea organisme bioluminescente autonome artificiale. Aici, descriem funcția și evoluția genelor cheie responsabile de bioluminescența ciupercii Neonothopanus nambi și arătăm că expresia genelor fungice este suficientă pentru a proiecta în mod autonom eucariote bioluminescente.aproximativ 100 de specii fungice din ordinul Agaricales emit lumină utilizând aceeași reacție biochimică (12)., Deși rolul ecologic al bioluminescenței lor nu este pe deplin înțeles, există dovezi că ar putea fi folosit de ciuperci pentru a atrage insecte Distribuitoare de spori (13). Fungice bioluminiscență a fost cunoscut de a utiliza cel puțin patru componente: oxigen molecular; la luciferin, care a fost recent identificat ca 3-hydroxyhispidin ; și două nedescrise anterior enzime cheie, un NAD(P)H-dependente hidroxilază și luciferază (15, 16).pentru a identifica enzimele căii bioluminescente fungice, ne-am concentrat mai întâi pe izolarea genei luciferazei. Prin exprimarea N., nambi adnc bibliotecă în Pichia pastoris și pulverizare plăci de agar cu sintetic 3-hydroxyhispidin, am identificat și ordonate de o luminescente colonie de drojdie exprimarea luciferază gene (SI Anexa, Fig. S1 și S13). Luciferaza N. Nambi, nnluz, este o proteină 267-aa (apendicele SI, Fig. S2) și nu are omologi descriși sau similitudine pronunțată a secvenței cu domeniile proteice conservate, reprezentând o familie de proteine noi.genele care codifică enzimele care sintetizează metaboliții secundari sunt adesea grupate în genomii fungici (17)., Am emis ipoteza că acesta poate fi cazul enzimelor cascadei bioluminescente, deoarece se crede că cascada este conservată printre ciupercile bioluminescente (12). Astfel, am căutat gene legate de biosinteza luciferinei în vecinătatea genei luciferazei din genomul N. nambi. În plus față de N. nambi, avem, de asemenea, secvențiat genomul și transcriptomes de bioluminiscente ciuperci Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, și Panellus stipticus și le-a comparat cu dispoziția publicului secvențe genomice de bioluminiscente și nonbioluminescent ciuperci (18, 19)., Am constatat că luciferază este un membru al unei gene conservate de bord, care include cel puțin alte două gene: h3h și hisps (Fig. 1 B și C și seturile de date S1-S3).
calea biosintezei Luciferinei în bioluminescența fungică și clusterul de gene care conține enzime cheie în clada ciupercilor bioluminescente. (A) calea propusă de biosinteză și reciclare a luciferinei fungice. Acid cafeic este convertit la hispidin de hispidin sintetazei (HispS) și hidroxilat de H3H, obținându-3-hydroxyhispidin (fungice luciferin)., De luciferază (Luz) adaugă oxigen molecular, producând un endoperoxide ca o mare energie intermediar, cu descompunere care produce oxyluciferin (caffeylpyruvate) și emisie de lumină. Oxiluciferina poate fi reciclată în acid cafeic prin hidrolază de caffeilpiruvat (CPH). (B) reprezentarea Schematică a genomice grup de N. nambi conțin luciferază, H3H, hispidin sintetazei, și caffeylpyruvate hidrolaza (cph) de gene. (C) cluster de Gene în clada ciupercilor bioluminescente. Arborele speciilor din stânga se bazează pe compararea genelor care codifică proteinele împărtășite de majoritatea speciilor analizate., Crucile roșii marchează ramurile copacului care în cele din urmă au pierdut capacitatea de a străluci. Dreapta arată structura clusterului de gene care conține luciferază dacă un astfel de cluster a fost găsit în genomul relevant. Genele care codifică pentru luciferază (luz), h3h, hispidin sintetazei (hisps), și caffeylpyruvate hidrolaza (cph) sunt colorate. Bricheta culorile albastru și roșu de hisps și luz gene indică faptul că doar o parțială sau trunchiate gena a fost găsit în Armillaria mellea și Guyanagaster necrorhiza, respectiv. Alte gene care ar putea aparține clusterului sunt numite de la O1 la O4 (colorate în gri)., Căpușele verzi reprezintă o genă asemănătoare citocromului P450 (diferite nuanțe de verde indică diferite grupuri ortologe), iar căpușele negre indică alte gene.
h3h gene arătat secvență similitudine cu 3-hidroxibenzoat 6-monooxygenases, enzime care catalizează oxidarea 3-hidroxibenzoat folosind NADH și oxigen molecular. Această reacție este identică cu cea care transformă hispidina în luciferină (Fig. 1A); astfel, am emis ipoteza că h3h gene coduri pentru hispidin-3-hidroxilaza (H3H), enzima corespunzătoare a prezis hidroxilază (15)., Am clonat gena de la N. nambi și a constatat că P. pastoris colonii exprimă atât nnluz și nnh3h emite lumina atunci când este pulverizat cu luciferin precursor hispidin, spre deosebire de controlul colonii exprimarea nnluz singur (SI Anexa, Fig. S14 și S17)—confirmând că nnh3h transformă hispidina în luciferin.
gena hisps (Fig. 1C) codifică un membru al familiei poliketide sintază, enzime care produc metaboliți secundari într-o varietate de organisme din arborele vieții (20)., Polyketide synthases de obicei adaugă malonil moieties la creșterea catenei de atomi de carbon; astfel, α-pyrone natura hispidin sugerat că biosintezei sale pot fi efectuate de către un polyketide sintetaza acidului cafeic cu două cicluri de plus de malonil unități, urmat de lactonization (Fig. Anexa 1A și SI, Fig. S3). Modular mare polyketide synthases necesită modificări post-traducere pentru activitatea lor (21 de ani), cum ar fi transferul de phosphopantetheinyl grup la un conservate serină reziduuri de acil proteină purtător de domeniu., Pentru a testa dacă hisps genă poate produce luciferin precursor într-un sistem heterolog, ne-am integrat hisps, nnluz, și nnh3h gene împreună cu Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl transferază npgA în genomul P. pastoris. Când sunt cultivate într-un mediu care conține acid cafeic, drojdiile care exprimă toate cele patru gene emit lumină văzută cu ochiul liber (Fig. 3A), în timp ce nu s-a observat o producție ușoară semnificativă la tulpinile lipsite de gene npgA sau hisps (apendicele SI, fig. S15 și S17)., Prin urmare, hisps catalizează sinteza hispidinei din acidul cafeic, închizând lanțul de reacții („ciclul acidului cafeic”) de la un metabolit celular comun cu biosinteză cunoscută la o luciferină eucariotă.la unele specii bioluminescente de ciuperci, clusterul genomic găzduiește una sau două gene suplimentare (Fig. 1C): una aparținând familiei citocromului P450, iar cealaltă aparținând familiei hidrolazelor fumarilacetoacetate., Acesta din urmă (cph) probabil codifică o caffeylpyruvate hidrolaza (set de Date S4) implicate în oxyluciferin de reciclare, conforme cu caffeylpyruvate, fungice oxyluciferin, fiind hidrolizat la caffeate și piruvat de o hidrolază prezent în fungice extractelor brute (22).
de Conservare a genei cluster sugerează că, în contrast cu alte grupuri de organisme bioluminiscente (23), bioluminiscență evoluat în ciuperci doar o singură dată, cu luz, h3h, și hisps gene emergente prin gene duplicate. Arbori filogenetici reconstruiți pentru genele luz, h3h și hisps (apendicele SI, fig., S4 – S6) și arborele speciei din ordinul Agaricales (Fig. 2) dezvăluie evoluția cascadei de bioluminescență în ciuperci. Enzima primară luz a cascadei de bioluminescență fungică a apărut printr-o duplicare a genelor la baza Agaricales urmată de duplicarea h3h și heps câțiva milioane de ani mai târziu. Interesant, multe specii într-un mare grup de codare hisps sunt nonbioluminescent, și hisps omologii din specii bioluminiscente lipsa două domenii, ketoreductase și dehydratase domenii (SI Anexa, Fig. S6)., Este probabil ca pierderea de aceste domenii funcționale, în strămoș comun de specii bioluminiscente favorizat producerea de α-pyrones de rudenie hisps, eventual, oferind pasul final pentru apariția de bioluminiscență.
filogenia speciilor de Agaricales în care genomii sunt secvențiați. Dreptunghiurile cu numele genelor indică unde au apărut genele luz, h3h și hisps ca urmare a duplicării. Un oval în clada bioluminescenței (BL) indică strămoșul comun al tuturor speciilor bioluminescente., Crucile roșii marchează ramurile copacului care în cele din urmă au pierdut bioluminescența. Liniile de ciuperci bioluminescente sunt de asemenea prezentate în aceeași cladă. Scara estimează numărul de substituții pe site.
clusterul de gene a continuat să evolueze dinamic după achiziționarea bioluminescenței. Cel puțin șase evenimente independente de pierdere completă sau parțială a genelor din clusterul genomic au dus la pierderea secundară a bioluminescenței (Fig. 2). Gena cph a fost inserată în cluster în clada nonmicenoidă, posibil de două ori (Fig. 1)., Acest model de mozaic se aseamănă cu istoria evoluției de proteine fluorescente (24), un alt vizual relevant familie de proteine cu un clar rolul biologic, și poate indica faptul că selectivă avantaj oferit de bioluminiscență în ciuperci depinde de un anumit sau tranzitorii context ecologic.adaptările complexe pot fi o sursă de soluții relevante din punct de vedere biotehnologic., Pe lângă dezvăluirea naturii proceselor fotochimice de bază și a evoluției proteinelor, luciferazele se numără printre tipurile primare de gene reporter utilizate în diverse conducte de cercetare, metode de diagnosticare și aplicații de mediu (5, 6, 25). Pentru a determina dacă o cale bioluminescentă fungică poate furniza gene reporter, am caracterizat nnLuz in vitro și am testat capacitatea sa de a produce lumină în sistemele heterologe.proteina nnLuz constă din 267 aminoacizi și are masa moleculară de aproximativ 28,5 kDa (apendicele SI, Fig. S7)., Deși localizarea sa celulară in vivo rămâne necunoscută, proteina are o helix transmembranar n-terminal prezis, în concordanță cu colocalizarea activității luciferazei cu fracții celulare insolubile în studiile anterioare (22). Când este exprimat în P. pastoris, nnLuz a fost asociat cu fracția microzomală (apendicele SI, Fig. S8) și lumină verde emisă cu un maxim la 520 nm și spectru identic cu cel al miceliului N. nambi (Fig. Apendicele 3A și SI, Fig. S9). Nnluz Recombinant emite lumină optim la aproximativ pH 8.,0 și temperaturi moderate, pierzându-și activitatea la temperaturi de peste 30 °C (apendicele SI, Fig. S10).
Luciferaza fungică ca genă reporter. (O) Fotografie de P. pastoris celule care exprimă nnluz, nnh3h, nnhisps, și npgA gene în creștere într-un mediu care conține acid cafeic. Fotografia a fost făcută pe o cameră NIKON D800, ISO 1600, expunere 8 s. (B) celulele Hek293nt umane cotransfectate cu luciferază fungică (canal verde) și proteină fluorescentă roșie Katushka (canal violet). Fungic luciferin a fost adăugat la mediu până la concentrația finală de 650 µg/mL înainte de obținerea imaginii., (C) Imagine de un mouse cu s.c. injectat murin carcinom cu celule CT26 își exprimă nnluz (pe stânga) sau P. pyralis luciferază (pe dreapta), după ce am.p. administrarea unui amestec de fungice (0,5 mg) și firefly (0,5 mg) luciferins. Culoarea indică intensitatea luminii emise. (D) expresia genei nnluz într-un embrion X. laevis. Dreptul embrionului fost microinjected cu amestecul de rodamină lizină dextran și nnluz arnm la cele două celule etapă, și apoi, a fost microinjected cu luciferin în blastocoel cavitate la stadiul de gastrula., Ca un control, stânga embrionul a fost microinjected cu rodamină lizină dextran numai la cele două celule etapă, și apoi, a fost, de asemenea, microinjected cu luciferin în blastocoel cavitate la stadiul de gastrula. Canalul violet indică fluorescența rodaminei, iar canalul verde indică bioluminescența nnLuz.pentru a testa potențialul nnluz ca genă reporter în sistemele heterologe, am testat expresia sa în Escherichia coli, P. pastoris, embrioni Xenopus laevis timpurii și celule umane., Deși luciferaza s-a acumulat mai ales în corpurile de incluziune atunci când este exprimată în bacterii (apendicele SI, Fig. S7), toate celulele și organismele testate care exprimă nnluz de tip sălbatic au fost în mod clar bioluminescente atunci când 3-hidroxihispidina a fost adăugată la mediu (Fig. 3 și apendicele SI, fig. S11 și S22). Am comparat, de asemenea, nnLuz calitativ cu luciferază de la firefly Photinus pyralis într-un întreg-corp imagistica de configurare de xenogrefe tumorale la șoareci. Noi S. C., implantat cantități egale de murine carcinom de colon celulele își exprimă nnluz sau firefly luciferază sub același promotor, a injectat un amestec de licurici și fungice luciferins eu.p., și a obținut aproape identice semnale de implanturi (Fig. 3c).în cele din urmă, ne-am propus să testăm dacă biosinteza luciferinei poate fi realizată în organisme lipsite de biosinteză a acidului cafeic. Introducerea a trei gene suplimentare care codifică enzimele biosintezei acidului cafeic din tirozină, Rhodobacter capsulatus tirozină amoniac liază și două E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase componente (26), în genomul P. pastoris tulpina realizarea npgA, hisps, h3h, și luz gene a dus la o tulpina care a fost în mod autonom bioluminiscente atunci când crescut într-un standard de drojdie mediu (SI Anexa, Fig. S12 și S16).astfel, în toate condițiile testate, luciferaza N. Nambi de tip sălbatic este funcțională în sistemele heterologe, poziționându-se ca o genă reporter promițătoare, iar luciferina fungică poate fi sintetizată din aminoacizi aromatici în alte eucariote., În plus, fungic luciferin este un compus solubil în apă și permeabil la celule, iar reacția sa de emisie de lumină nu depinde de disponibilitatea ATP, făcând sistemul bioluminescent fungic atractiv pentru numeroase aplicații în imagistica biomedicală. Mai mult, diferiți analogi de luciferină pot fi utilizați pentru a spori emisia de lumină și pentru a regla spectrele sale, îmbunătățind penetrarea luminii în aplicațiile imagistice tisulare profunde (22).în concluzie, prezentăm Cascada enzimatică care conduce la emisia de lumină în ciuperci, care este un sistem de bioluminescență eucariotă cu biosinteză cunoscută a luciferinei., Am arătat că luciferin este sintetizat din precursorul său hispidin de N. nambi H3H și că hispidin poate fi direct sintetizate de hispidin sintetaza acidului cafeic, un răspândită celulare metabolit cu eficienta biosinteza, care a fost realizat în diverse organisme, inclusiv industriale relevante tulpini de drojdie (26)., Doar două etape enzimatice din mainstream căi metabolice, fungice sistem are un mare potențial pentru biologia sintetică a crea în mod autonom stralucitoare animale și plante: încercările de a dezvolta astfel de organisme au fost constrâns de către performanță slabă în eucariote de bacterii bioluminiscente, singurul sistem pentru care luciferin biosinteza a fost cunoscut (27, 28).reconstituirea căii bioluminescente fungice în organismele eucariote ar putea permite aplicații în care țesuturile sau organismele raportează modificări ale stării lor fiziologice cu emisie de lumină autonomă., De asemenea, ar putea impulsiona dezvoltarea următoarei generații de arhitectură organică (29), în care plantele strălucitoare modificate genetic vor fi integrate în clădiri și în infrastructura orașului. În afară de aceasta, cu istoria sa evolutivă intrigantă, o familie de luciferaze și simplitatea generală, Sistemul bioluminescent fungic prezentat aici este un loc de joacă molecular care deține numeroase oportunități de cercetare de bază și aplicată.,apendicele SI include detaliile materialelor și metodelor utilizate în acest studiu, inclusiv experimente cu embrioni Xenopus, șoareci, drojdii, bacterii, celule de mamifere și analize bioinformatice. Experimentele pe animale au fost aprobate de către comitetul local de etică al Pirogov National Research Medical University din Rusia și au fost efectuate în conformitate cu Directiva Uniunii Europene 2016/63/UE.
Genomul P. stipticus, Lentinula edodes, N. gardneri, N. nambi, și M. citricolor și transcriptomes de P. stipticus, L. edodes, și N., gardneri sunt disponibile la Centrul National pentru Biotehnologie Informații Bioproject PRJNA476325. Transcriptomes de N. nambi și M. cirticolor, aliniamente de P. pastoris secventiere a genomului citește, și de aliniere de secvențe de proteine fungice luciferases sunt disponibile la Figshare (https://figshare.com/articles/A_genetically_encodable_bioluminescent_system_from_fungi/6738953/2). Fișiere folosite pentru a reconstrui Agaricales specii de copac, inclusiv prime și împodobite aliniamente și RAxML fisierele rezultate, sunt disponibile la Figshare (https://figshare.com/articles/Species_tree_files/6572117). Secvente de hisps, h3h, luz, și cph genele studiate specii de ciuperci sunt disponibile ca Seturi de date S1–S4.,mulțumim lui Sergey Shakhov pentru fotografie și Mary Catherine aime și Rachel Koch pentru că ne-au permis să folosim datele obținute din genomul lui G. necrorhiza MCA 3950. Ansamblul de plasmide pentru experimente cu celule de mamifere și Xenopus embrioni a fost susținută de către ruși Science Foundation Grant 17-14-01169, și caracterizarea biochimică a luciferază a fost susținută de către ruși Science Foundation Grant 16-14-00052. Această cercetare a fost susținută de Planta LLC și Evrogen sa., Imagistica IVIS și experimentele pe animale au fost efectuate folosind echipamentul Centrului de utilizare colectivă „Nanobiotechologies medicale” situat în Universitatea Națională de Cercetare Medicală din Rusia. Experimentele au fost parțial realizate folosind echipamente furnizate de Institutul de Chimie Bioorganica al Academiei ruse de Științe de Bază Facilitate (CKP IBCH; sprijinit de Ministerul rus al Educației și Științei Acordă RFMEFI62117X0018). T. G. și M. M.-H., recunosc sprijin de la Ministerul spaniol al Economiei și Competitivității Grant BFU2015-67107 cofinanțat prin Fondul European de Dezvoltare Regională, Consiliul European pentru Cercetare (ERC) Grant ERC-2012-StG-310325 în cadrul celui de al Șaptelea Program-Cadru PC7/2007-2013, și a Uniunii Europene de Cercetare și Inovare Orizont 2020 Program sub Marie Sklodowska-Curie Grant H2020-MSCA-ITN-2014-642095. F. A. K.,sprijinul HHMI Internaționale la Începutul Carierei om de Știință Program 55007424, Ministerul spaniol al Economiei și Competitivității (MINECO) Acordă BFU2012-31329 și BFU2015-68723-P, MINECO centrul de Excelență Severo Ochoa 2013-2017 Grant SEV-2012-0208, Secretara d’Universitats am Recerca del Catedra d ‘ Economia nu Coneixement de la Generalitat Agenția pentru Managementul Universității și Cercetării Programul de Granturi 2014 SGR 0974, Centre de Recerca de Catalunya Program de Generalitat de Catalunya, și finanțare CEC 335980_EinME în cadrul celui de al Șaptelea Program-Cadru PC7/2007-2013., H. E. a., A. G. O. și V. S. recunosc sprijin din São Paulo Research Foundation (Fundação de Amparo à Pesquisa face Estado de São Paulo, Granturi 11/10507-0 la H. E. W.), 10/11578-5 (pentru A. G. O.), și 13/16885-1 (V. S.).