ser fetal de vițel dezbrăcat cu cărbune (vezi și Ref. 3)
1
adăugați 250 mg de cărbune și 25 mg de Dextran T-70 la 100 ml de ser de vițel fetal (FCS).
2
se incubează la 56°C timp de 30 min.
3
centrifugați la 3000-4000 rpm timp de 30 min la temperatura camerei.
4
transferați supernatantul în găleți proaspete.
5
repetați pașii anteriori.
6
filtrați supernatantul printr-un prefilter (tip AP; Millipore, Bedford, MA) pentru a îndepărta cărbunele.
7
filtrați soluția printr-un 0.,Filtru de dimensiune a porilor 45-μ m (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
depozitați alicote la -20°C.
gelatină (10 × stoc)
1
faceți o soluție 1% (g/v) de gelatină (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
autoclavă timp de 20 min.a se păstra la 4°C. Vase/Sticle acoperite cu gelatină
1
se diluează stocul de gelatină de 10 ori.
2
pipetați această soluție pe vase pentru a acoperi complet suprafața vasului (1, 5 până la 2 ml pe vas de 6 cm).
3
lăsați vasele timp de 2 ore la temperatura camerei. Pentru a grăbi această procedură, acestea pot fi plasate în incubator la 37°C timp de 1 oră.,
4
aspirați vasele.înfășurați vasele în folie de aluminiu și păstrați-le la temperatura camerei sau la 4°C.
tampon HEBS (10× stoc)
1 2
adăugați apă dublă distilată la 975 ml.
3
reglați pH-ul la 7,05 și volumul la 1000 ml.
4
Autoclavați soluția și păstrați-o la 4°C.
5
înainte de utilizare, soluția de glucoză filtrată este adăugată în tampon (vezi prepararea 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
se diluează HEBS 10× stoc de cinci ori cu H2O steril.
2
se adaugă 0, 2 ml dintr-o soluție de glucoză filtrată (1 g / ml) la 100 ml (concentrație finală, 10 mM).,
3
reglați pH–ul la 7,05-7,08. Acest pas este crucial pentru formarea complexului ca–ADN.
4
sterilizați soluția prin filtrare.
Fosfat salin (PBS) fără calciu și magneziu (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
Normal mediu: Preparate cu non-termice-inactivat FCS și mijlocii cu roșu fenol
Steroid cu depleție de mediu: Preparate cu cărbune-dezbrăcat FCS și mijlocii fără roșu de fenol. Acest mediu este utilizat numai atunci când efectul hormonilor, prezenți în mod normal în ser, trebuie testat.,când cantitatea totală de ADN este mai mică de 8 până la 10 µg, trebuie adăugat ADN purtător (plasmidă sau ADN de spermă de hering) pentru a obține un precipitat bun de Ca–ADN
Liza ADN-ului este mai mică de 8-10 µg, ADN purtător (plasmidă sau ADN de spermă de hering) pentru a obține un precipitat bun de ca-ADN
tampon