1 Introducere
Integrantă proteinele membranare alcătuiesc o mare parte din genomul de multe organisme—aproximativ 25% din genomul uman—și de a efectua o gamă variată de funcții, inclusiv măsurile-cheie în comunicarea de celula cu mediul său., Din cauza lor biologice și importanța terapeutică (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), proteinele membranare se axează fundamentale și aplicate cercetărilor biofizice pentru a caracteriza structuri tridimensionale, dinamica, și interacțiuni în nativ-ca medii.,
Soluție-stat spectroscopie RMN a jucat un rol critic în proteină a membranei biofizice studii, ca site-specific dinamic și interacțiunea informațiile furnizate de astfel de abordări frumos completează structurale datele obținute din difracția de raze X, crio-EM, și de calcul de analize (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & din marassi, 2017)., Fundamentală pentru astfel de studii sunt mai multe 2D „amprente spectra,” de cele mai multe ori 15N/1H HSQC (heteronucleari single-coerența cuantică) spectrele (pentru coloana vertebrală amide plus Trp, Asn și Gln sidechains) sau metil 13C/1H HMQC (heteronucleari multiple-coerența cuantică) spectrele de catenă laterală de grupuri de metil (Basher et al., 2008). Aceste experimente direcționate către metil sunt deosebit de avantajoase pentru complexele mari de proteine/lipide cu membrană lentă; experimentele direcționate către alte site-uri de lanț lateral și lanț principal au fost aplicate cu succes., RMN experimentele se pot oferi informații despre proteine dinamica pe mai multe intervale de timp, de la rapid (ps–ns) catenă laterală propuneri pentru a încetini modificări conformaționale (µs–ms) (Kasinath, Ascuțit, & Bagheta, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Bagheta, Moorman, & Harpole, 2013)., Multe dintre aceste experimente dinamica, de multe ori folosind catenă laterală de grupuri de metil ca sonde, au fost adaptate și dezvoltate pentru marile sisteme biomoleculare și poate fi folosit pentru proteinele membranare (Rosenzweig & Kay, 2014; Soare, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
Un anumit avantaj de soluție-state NMR este că proteinele sunt studiate într-un nativ-ca soluție stat unde se pot interconvert între mai multe conformații., Cu toate acestea, proteinele membranare trebuie solubilizate într-un mimetic adecvat al membranei care menține structura și dinamica nativă. Diferite opțiuni includ detergent micele, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, și vezicule lipidice, fiecare având propriile avantaje și dezavantaje (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cruce, 2013). Este adesea necesar să se testeze diferite strategii de solubilizare pentru o probă de proteine dată pentru stabilitate, intensitatea și rezoluția semnalului și structura/activitatea nativă., Două considerente importante pentru toate mimeticele membranei sunt (1) o dimensiune uniformă și Mică a particulelor și (2) o măsură mare de deuterare.deuterarea la nivel înalt, atât în membrana mimetică, cât și în proteina în sine, este esențială pentru a reduce numărul de semnale 1h prezente în spectre (inclusiv cele din lipide, care pot fi intense) și pentru a îmbunătăți caracteristicile de relaxare ale rotirilor active RMN rămase în eșantion., În timp ce deuteration este posibil ca membrana mimetic, prin achiziționarea/sinteza deuterat compuși, înlocuirea 1H cu 2 ORE în proteine necesită biosinteză constitutive. Pentru experimentele coloanei vertebrale în sistemele de Expresie eucariote, se poate eticheta uniform cu 15N pentru a observa toate amidele (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) sau prin adaos de etichetate în mod special aminoacizi (Isogai et al., 2016)., Pentru grupuri de metil, se poate oferi fie etichetate în mod adecvat amino acizi sau aminoacizi precursori (în special alfa-ceto-acizi) pentru creșterea mass-media pentru a accesa diverse modele de etichetare în sidechains de mai mulți aminoacizi (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind izoleucina δ1 grupuri de metil deosebit de util având în vedere (1) abundența de Ile reziduuri în integrantă proteinele membranare, inclusiv GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) de departe fata 13C schimbare de izoleucina δ1 grupuri de metil , punându-le într-o deosebit de uncrowded regiunea 2D 13C/spectrele 1H, (3) lipsa de necesitatea de a stereospecifically atribui aceste grupuri de metil, spre deosebire de Val si Leu, și (4) prezența de multiple, liber rotativ legăturile dintre gruparea metil și proteine vertebrală, oferind substanțial independența față de dinamica de la aceste site-uri (Kasinath et al.,, 2013).în timp ce multe dintre strategiile de etichetare menționate mai sus au fost bine dezvoltate pentru E. coli, multe proteine membranare integrale pot fi exprimate doar la niveluri ridicate în gazdele eucariote. Printre acestea, methylotrophic drojdie Pichia pastoris este un convenabil gazdă pentru heterolog exprimare și izotopice etichetarea eucariote proteinele membranare (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Avantajele Pichia includ rapiditatea de manipulare genetică, randamente ridicate de proteină recombinantă, existența post-traducere modificare (PTM) și supraveghetor de utilaje necesare pentru eucariote proteinele membranare, și capacitatea de a crește pe definit minimal mass-media care să permită perdeuteration (Ubaldo & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Etichetarea izotopică uniformă în Pichia a fost bine stabilită (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‘ Leary, 2004)., Ne-am extins acest lucru demonstrând 13C, 1H etichetarea izoleucina δ1-grupuri de metil într-un perdeuterated fundal, prin adăugarea de etichetat α-ketobutyrate (~ 50% etichetare, ~ 90% deuteration) foarte deuterat mass-media de creștere (Clark et al., 2017, 2015). În contrast, simultană etichetare de leucina δ – valină și γ-metil grupuri cu α-ketoisovalerate este ineficient, dar poate fi realizat prin adăugarea etichetate valină direct la mass-media de creștere sau de a modifica condițiile de cultură (Clark et al., 2015; Suzuki și colab., 2018; Zhang și colab., 2017)., Pichia poate lua ușor suplimentare de aminoacizi din mass-media, cu un general de corespondență între asimilarea eficiența și costul energetic pentru a sintetiza aminoacizii tip de novo (Heyland, Fu, Gol, & Schmid, 2011). Cu toate acestea, după preluarea de către celule, etichetate aminoacizi poate fi alimentat în căile metabolice (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), diluarea semnal de dorit aminoacizi și complică analiza datelor de izotopice de codare., Alternativ, tulpinile auxotrofice pot fi dezvoltate pentru etichetarea unui aminoacid specific; cu toate acestea, trebuie avut grijă să se confirme că nu apar efecte off-țintă în alte căi metabolice (Whittaker, 2007).aici oferim protocoale detaliate necesare pentru a genera astfel de proteine membranare integrale marcate cu u-2h (13C, 1h-Ile δ1 metil) prin supraexpresie în Pichia, folosind receptorul uman de adenozină A2A ca sistem model., Ne mai multe detalii cum astfel de probe pot fi utilizate în soluție studiile RMN, de la dobândirea simplu 13C/1H HMQC spectra, prin deplasarea chimică misiuni de site-regizat de mutageneză, de la analize de 1H–1H cross-relaxare măsurători de repede catenă laterală dinamica.