… bactoscan FC bazat, care utilizează bromură de etidiu pentru a pata bacteriile din lapte, oferă un rezultat după 8 min (5, 30). O tehnică citometrică în flux pentru măsurarea TBC în laptele brut și ultrahigh cu pata SYTO BC a fost, de asemenea, descrisă anterior (16). Cu toate acestea, aceste tehnici sunt fie foarte specifice, detectând doar o specie, fie nespecifice, detectând toate bacteriile., Tehnicile citometrice în flux pentru diferențierea bacteriilor din lapte în grupuri mai mari, cum ar fi bacteriile gram-pozitive și gram-negative, nu au fost încă descrise. Colorarea Gram a fost descrisă inițial în 1883 de colegul lui Christian Gram Carl Friedlander, împărțind bacteriile în două grupuri, iar din nou în 1884 de Christian Gram (12, 14). Procedura convențională de colorare Gram include petele crystal violet și safranin. Celulele fixate la căldură pe o lamelă sunt colorate albastru-violet cu violet de cristal și, ulterior, sunt tratate cu etanol., Bacteriile Gram-negative sunt decolorate de etanol, în timp ce bacteriile gram-pozitive rămân colorate cu violet de cristal. În continuare, safranin este utilizat pentru a contracara bacteriile gram-negative, dând acestui grup un aspect roz. Au fost raportate numeroase abordări alternative pentru identificarea reacției Gram. O metodă în care o colonie de bacterii este supusă la 3% hidroxid de potasiu este utilizată pe scară largă. Concentrația ridicată de hidroxid de potasiu lizează bacteriile gram-negative, eliberând ADN-ul din celule, ceea ce poate fi confirmat prin tragerea unui șir vâscos din colonie (15, 26)., A fost descrisă o tehnică alternativă de colorare Gram cu o aglutinină din germeni de grâu lectină conjugată cu fluoresceină (WGA) pentru epifluorescență combinată și un microscop cu contrast de fază (29). WGA se leagă de N-acetilglucozamină în stratul pep – tidoglican al peretelui celular. Bacteriile Gram-negative au un strat de lipopolizaharidă care acoperă peretele celular și de aceea nu sunt colorate cu WGA, în timp ce bacteriile gram-pozitive sunt colorate cu WGA, deoarece nu au un strat lipopolizaharidic., Aceste rezultate au arătat o insensibilitate față de vârsta culturii, ceea ce a presupus că această pată ar putea fi utilizată direct pe probe fără precultivarea probei. O versiune modi fi ed a tehnicii WGA a fost descrisă pentru bacteriile găsite într-un mediu non-alimentar în care bacteriile sunt imobilizate pe un lter fi, spălate și apoi colorate cu WGA (11). Au fost propuse și unele tehnici de colorare Gram pentru citometria fl ow. Se folosește pata lipofilă fluorescentă rho-damine 123, care colorează selectiv bacteriile gram-pozitive., Stratul lipopolizaharidic al bacteriilor gram-negative pre-aerisește intrarea rodaminei 123 (1, 28). O altă tehnică similară combină cele două fl uorescent legarea ADN pete, SYTO 13 și hexidium iodură (HI). SYTO 13 este o membrană permeabilă la pata, și HI este blocat de lipopolysaccharide strat de bacterii gram-negative și, astfel, numai permeabil la bacterii gram-pozitive și bacterii gram-negative, cu o de – a stabilizat lipopolysaccharide strat (22). Cu toate acestea, datorită naturii fragile a stratului lipopolizaharidic, se consideră că aceste tehnici nu sunt adecvate pentru probele necultivate., Scopul prezentei lucrări a fost de a dezvolta o tehnică de colorare Gram bazată pe colorarea bacteriilor cu WGA și HI și urmată de detectarea citometrică a fl ow. Tehnica a fost evaluată pe lapte-bacterii asociate (19, 20) în faza staționară și după 6, 12 și 48 de ore de incubare în laborator mass-media. Mai mult, metoda a fost testată pe culturi de fază staționară care au fost păstrate timp de 24 de ore la Ϫ 18 ° C și timp de 14 zile la 5 ° C. În cele din urmă, tehnica a fost aplicată laptelui din rezervor în vrac, cu bacterii cunoscute., O tehnică de diferențiere a bacteriilor gram-pozitive și gram-negative în laptele de rezervor în vrac fără precultivare va fi applicarea finală. Figura 1 prezintă efectul concentrației de KCl asupra legării WGA de bacteriile gram-pozitive M. luteus și S. uberis , atunci când bacteriile sunt colorate numai de WGA, excluzând HI. În histograme, zgomotul este văzut la stânga, unde s – au acumulat evenimente cu intensități scăzute de fluorescență (un prag vechi a fost folosit pentru a tăia cea mai mare parte a zgomotului)., Când bacteriile sunt colorate în mod adecvat pentru a le distinge de zgomot, ele vor apărea ca un vârf complet separat de zgomot. Folosind 0 m KCl, niciuna dintre cele două bacterii nu a fost suficient de colorată pentru a le separa de zgomot. Folosind 1 m KCl, s – a observat o intensitate crescută a fluorizării pentru ambele bacterii. M. luteus a fost apoi separat de zgomot, iar S. uberis a depășit ușor zgomotul. Creșterea concentrației de KCl la 3 M a îmbunătățit în continuare legarea (intensități mai mari de fluorescență) a WGA la aceste tulpini de bacterii, în special pentru M. luteus ., Observațiile microscopice au demonstrat că bacteriile gram-pozitive au fost colorate de WGA, în timp ce bactele gram-negative nu au fost colorate de WGA. Bună a colorat atât bacteriile gram – pozitive, cât și cele gram-negative. Figura 2 prezintă un exemplu de colorare a unui amestec (1:1) de M. luteus gram-pozitiv și E. coli gram-negativ atât cu WGA, cât și cu HI. Ca urmare a colorării, M. luteus a apărut cu o suprafață verde (WGA) și o citoplasmă roșie (HI), în timp ce E. coli a apărut doar cu o citoplasmă roșie. Parcele izometrice ale analizelor Cito – metrice ale culturilor de E. coli, M., luteus, și un amestec (1: 1) dintre acestea sunt prezentate în Fig. 3. Măsurarea E. coli singur (Fig. 3A), 100% din evenimente au fost prezente în regiunea gram-negativă. Numai pentru M. luteus (Fig . 3B), 99% dintre evenimente au fost în regiunea gram-pozitivă și 1% dintre evenimente au intrat în regiunea gram-negativă. Când culturile de E. coli și M. luteus au fost amestecate (Fig. 3C), 50% din evenimente au fost observate în fiecare regiune. Fiecare dintre cele 12 tulpini bacteriene a fost măsurată în duplicat după 6,12, 24 și 48 h de incubare. Din fiecare măsurare, au fost utilizate 100 de evenimente pentru calcule. În Fig., 4 este prezentat un complot asamblat care include toate cele 800 de evenimente pentru fiecare dintre cele 12 tulpini bacteriene testate pe parcursul a 48 de ore de incubare (un total de 9.600 de evenimente). Fiecare tulpină bacteriană este prezentată cu o culoare distinctă. Este prezentată cea mai bună linie calculată pentru separarea bacteriilor gram-pozitive și gram-negative. În general, linia a asigurat interpretarea corectă a 97% din evenimente. Procentele de celule interpretate corect pentru tulpinile individuale au fost calibrate și sunt prezentate în tabelul 1. Pentru E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus , S. aureus, S. agalactiae , S., dys – galactiae , și S. uberis , aproape toate celulele ( Ͼ 96%) au fost interpretate corect pentru orice timp de incubare. Pentru B. cereus , P. fl uores – cens , și P. putida , Ͼ 93% din celulele au fost interpretate corect după 12 și 24 de ore de incubare, întrucât, după 6 și 48 de ore de incubare la doar 75 la 89% din celule au fost interpretate corect. În tabelul 2 sunt prezentate rezultatele analizelor citometrice ale culturilor supuse unor condiții de depozitare diferite., Când culturile au fost păstrate la 5 ° C timp de 14 zile, tehnica de colorare părea să fie în fl uenced de vârsta culturii, în special pentru bacteriile gram-negative. Procentul mediu de celule interpretate corect a fost de 86%. Pentru E. coli , M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae și S. uberis , cele mai multe celule ( Ͼ 97%) au fost corect interpretate. Pentru B. cereus, E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis și S. aureus , 76 până la 89% au fost interpretate corect, iar pentru P. fluorescens și P. putida , cifrele fi au fost de 58, respectiv 68%., Congelarea nu părea să aibă în vedere tehnica de colorare. După depozitare la Ϫ 18 ° C timp de 24 h, Ͼ 98% din celulele au fost interpretate corect de E. cloacae , E. coli , K. oxi – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae și S. uberis . Pentru B. cereus și P. fluorescens , cifrele fi au fost de 83, respectiv 82%. Figura 5 prezintă loturile izometrice de fl ow – citometrice anal-yses de S. aureus și E. coli adăugate la laptele din rezervor în vrac. Pentru S. aureus (Fig. 5A), 98% dintre evenimente au fost în regiunea gram-pozitivă și 2% dintre evenimente au intrat în regiunea gram-negativă., Pentru E. coli (Fig. 5B), 96% din evenimente au fost în regiunea gram – negativă și 4% din evenimente au intrat în regiunea gram-pozitivă. Contribuția bacteriilor naturale prezente în lapte a reprezentat mai puțin de 0,1%. Adăugarea unei concentrații ridicate de KCl la soluția de colorare a îmbunătățit capacitatea WGA de a colora bacteriile gram-pozitive. O posibilă explicație este că bacteriile gram-pozitive au teichoic acizi atașate perpendicular pe pereții celulelor, care, pentru unele bacterii gram-pozitive, poate bloca accesul WGA a peretelui celular., Atunci când concentrația de KCl este scăzut, structura teichoic acizi este rigid, dar prin creșterea concentrației de KCl, structura va fi desfăcut ca ionii de potasiu elimina taxele negative asupra teichoic acizi, provocând structurii la colaps (8, 9). Compoziția și structura teichoic acizi variază între gram-pozitive specii (24), ceea ce poate explica de ce o creștere în KCl de concentrație de la 1 la 3 M, a avut un efect mai mare pe M. luteus decât pe S. uberis . În lucrarea de față, 3 m KCl a fost utilizat pentru a maximiza legarea WGA la bacteriile gram-pozitive., Tehnicile de eliminare a organizării acizilor teichoici au fost raportate în prealabil numai pentru aplicații microscopice. Aceste tehnici includ utilizarea tetroxidului de osmiu prin adăugarea și evaporarea acetonului (2) și încălzirea bacteriilor pe o lamelă microscopică (29). Cu toate acestea, aceste tratamente nu au putut fi luate în considerare în studiul de față, deoarece o etapă de deshidratare nu este adecvată pentru citometria fl ow., Tehnica de colorare Gram a arătat rezultate fiabile pentru toate tulpinile după 6, 12, 24 și 48 h de incubare, pentru care aproape toate celulele (97%) au fost interpretate corect. Aceste rezultate sunt corelate cu rezultatele metodei de colorare Gram WGA re-portate …