serum płodu cielęcego pozbawione węgla drzewnego (patrz także Ref. 3)
1
dodać 250 mg węgla drzewnego i 25 mg dekstranu T-70 do 100 ml surowicy płodu cielęcego (FCS).
2
inkubować w temperaturze 56°C przez 30 min.
3
wirowanie przy 3000-4000 obr. / min przez 30 min w temperaturze pokojowej.
4
przelać supernatant do świeżych wiader.
5
powtórz poprzednie kroki.
6
przefiltruj supernatant przez filtr wstępny (Typ AP; Millipore, Bedford, MA), aby usunąć węgiel drzewny.
7
przefiltruj roztwór przez 0.,Filtr wielkości porów 45-μ m (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
przechowywać aliquoty w temperaturze -20°C.
żelatyna (10 × zapas)
1
wytwarzać 1% (w/v) roztwór żelatyny (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
autoklaw przez 20 minut.
3
Przechowywać w temperaturze 4°C.
Naczynia/Butelki pokryte żelatyną
1
żelatynowy wywar rozcieńczyć 10 razy.
2
pipetą tego roztworu na naczynia, aby całkowicie pokryć powierzchnię naczynia (1,5 do 2 ml na 6-cm naczynie).
3
pozostawić naczynia na 2 godz. w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć tę procedurę, można je umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę.,
4
5
owiń naczynia folią aluminiową i przechowuj je w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4°C.
bufor HEBS (10× zapas)
1 2
dodaj wodę podwójnie destylowaną do 975 ml.
3
ustawić pH na 7, 05, a objętość na 1000 ml.
4
roztwór należy Autoklawować i przechowywać w temperaturze 4°C.
5
przed użyciem do bufora dodaje się przefiltrowany roztwór glukozy (patrz przygotowanie 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
pięciokrotnie rozcieńczyć zapas HEBS 10× sterylną H2O.
2
dodać 0,2 ml przefiltrowanego roztworu glukozy (1 g / ml) na 100 ml (końcowe stężenie, 10 mM).,
3
Etap ten ma kluczowe znaczenie dla powstania kompleksu CA-DNA.
4
sterylizować roztwór przez filtrację.
sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
medium normalne: przygotowane z nie inaktywowanym termicznie FCS i pożywką z czerwienią fenolową
pożywka pozbawiona sterydów: przygotowane z pozbawionymi węgla drzewnego FCS i pożywką bez Czerwieni fenolowej. Podłoże to stosuje się tylko wtedy, gdy ma być badane działanie hormonów, zwykle obecnych w surowicy.,
Ilość plazmidu użytego na transfekcję
Reporterowa konstrukcja plazmidu, 6, 5 µg
wektor ekspresji, 1, 0 µg
plazmid ekspresji jako kontrola skuteczności transfekcji, 0, 5 µg
gdy całkowita ilość DNA jest mniejsza niż 8 do 10 µg, należy dodać DNA nośnika (plazmid lub śledziowe DNA plemników) w celu uzyskania dobrego osadu CA–DNA
Liza bufor