… na bazie BactoScan FC, który wykorzystuje bromek etydyny do barwienia bakterii w mleku, zapewnia wynik po 8 minutach(5, 30). Wcześniej opisano również technikę flow – cytometric do pomiaru TBC w mleku surowym i ultrawysokim z plamą syto BC (16). Jednakże techniki te są albo bardzo specyficzne, wykrywając tylko jeden gatunek, albo niespecyficzne, wykrywając wszystkie bakterie., Techniki cytometryczne przepływu różnicowania bakterii w mleku na większe grupy, takie jak bakterie gram-dodatnie i gram-ujemne, nie zostały jeszcze opisane. Barwienie grama zostało początkowo opisane w 1883 roku przez współpracownika Christiana grama, Carla Friedlandera, dzieląc bakterie na dwie grupy i ponownie w 1884 roku przez Christiana grama (12, 14). Konwencjonalna procedura barwienia Gram obejmuje plamy crystal violet i safranin. Ogniwa na szkiełku są barwione na niebiesko-fioletowo fioletem krystalicznym, a następnie poddawane są obróbce etanolem., Bakterie Gram-ujemne są odbarwiane przez Etanol, podczas gdy bakterie gram-dodatnie pozostają zabarwione fioletem krystalicznym. Następnie safranina jest używana do zwalczania bakterii gram-ujemnych, nadając tej grupie różowy wygląd. Opisano wiele alternatywnych metod identyfikacji reakcji grama. Metoda, w której kolonia bakterii jest poddawana 3% wodorotlenku potasu jest szeroko stosowana. Wysokie stężenie wodorotlenku potasu powoduje uwalnianie się bakterii gram-ujemnych, uwalniając DNA z komórek, co może być potwierdzone przez ściągnięcie lepkiego sznurka z Kolonii (15, 26)., Opisano alternatywną technikę barwienia metodą Gram-barwienia z aglutyniną kiełków pszenicy sprzężoną fluoresceiną (WGA) dla połączonej epifluorescencji i mikroskopu kontrastu fazowego (29). WGA wiąże się z N-acetyloglukozaminą w warstwie pep-tidoglikanu ściany komórkowej. Bakterie Gram-ujemne mają warstwę lipopolisacharydu pokrywającą ścianę komórkową i dlatego nie są barwione WGA, podczas gdy bakterie gram-dodatnie są barwione WGA, ponieważ nie mają warstwy lipopolisacharydu., Wyniki te wykazały niewrażliwość na wiek kultury, co sugerowało, że ta plama może być stosowana bezpośrednio na próbkach bez prekultywacji próbki. Została opisana modi Fi ed wersja techniki WGA dla bakterii znalezionych w środowisku nieżywnościowym, w którym bakterie są unieruchomione na fi lter, przemyte, a następnie zabarwione WGA (11). Zaproponowano również niektóre techniki barwienia metodą gram-barwienia dla cytometrii Flow. Jedna z nich wykorzystuje fluorescencyjną lipofilową plamę rho-damine 123, która selektywnie bejcuje bakterie gram-dodatnie., Warstewka lipopolisacharydowa bakterii gram-ujemnych przed wentylacją wstępuje do rodaminy 123 (1, 28). Inna podobna technika łączy dwie florescencyjne plamy wiążące DNA, syto 13 i jodek hexidium (HI). SYTO 13 jest plamą przepuszczalną przez błonę, a HI jest blokowany przez warstwę lipopolisacharydową bakterii gram-ujemnych, a zatem przepuszczalny tylko dla bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych bakterii z de-stabilizowaną warstwą lipopolisacharydową (22). Jednak ze względu na kruchość warstwy lipopolisacharydowej uważa się, że techniki te nie są odpowiednie dla próbek niekultywowanych., Celem niniejszej pracy było opracowanie techniki barwienia metodą Grama w oparciu o barwienie bakterii WGA i HI, a następnie wykrywanie cytometryczne Flow ow. Technikę oceniano na bakteriach związanych z mlekiem (19, 20) w fazie sta-tionary oraz po 6, 12 i 48 h inkubacji w środowisku laboranckim. Ponadto, metoda została przetestowana na hodowlach fazy Ary, które były przechowywane przez 24 h W Ϫ 18 ° C i przez 14 dni w 5 ° C. wreszcie, technika została zastosowana do mleka zbiornikowego z dodatkiem znanych bakterii., Technika różnicowania bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych w mleku zbiornikowym bez precultivation będzie ostatecznym AP-plication. Rysunek 1 pokazuje wpływ stężenia KCl na Wiązanie WGA z bakteriami gram-dodatnimi M. luteus i S. uberis, gdy bakterie są barwione przez WGA, z wyłączeniem HI. W histogramach szum widziany jest po lewej stronie, gdzie nagromadziły się zdarzenia o niskiej intensywności florescencji(do odcięcia większości szumu użyto progów)., Gdy bakterie zostaną zabrudzone, aby odróżnić je od hałasu, pojawią się jako pik całkowicie oddzielony od hałasu. Używając 0 M KCl, żadna z dwóch bakterii nie była wystarczająco poplamiona, aby oddzielić je od hałasu. Stosując 1 M KCl zaobserwowano zwiększoną intensywność fl uores-cence dla obu bakterii. „M. luteus” został wtedy oddzielony od szumu, A „S. uberis” tylko nieznacznie przesadził z hałasem. Zwiększenie stężenia KCl do 3 M dodatkowo poprawiło Wiązanie (wyższe intensywności florescencji) WGA z tymi szczepami bakterii, szczególnie dla M. luteus ., Obserwacje mikroskopowe wykazały, że bakterie gram-dodatnie były barwione przez WGA, podczas gdy gram-ujemne bacte-ria nie były barwione przez WGA. Witam serdecznie! Rysunek 2 przedstawia przykład barwienia mieszaniny (1:1) gram-dodatniego M. luteus i gram-ujemnego E. coli z WGA i HI. W wyniku barwienia M. luteus pojawił się z zieloną powierzchnią (WGA) i czerwoną cytoplazmą (HI), podczas gdy E. coli pojawił się tylko z czerwoną cytoplazmą. Wykresy izometryczne analiz Cyto-metrycznych kultur E. coli, M., luteus, a ich mieszanina (1:1) pokazana jest na Rys. 3. Pomiar samego E. coli (rys. 3A), 100% zdarzeń było obecnych w regionie gram-ujemnym. Tylko dla M. luteus (rys. 3B), 99% zdarzeń było w regionie gram-dodatnim, a 1% zdarzeń weszło w Region gram-ujemny. Kiedy mieszano Kultury E. coli i M. luteus (rys. 3C), 50% zdarzeń obserwowano w każdym regionie. Każdy z 12 szczepów bakterii został zmierzony w dwóch egzemplarzach po 6,12, 24 i 48 godzinach inkubacji. Z każdego pomiaru do obliczeń wykorzystano 100 zdarzeń. Na Rys., 4 przedstawiono zmontowany wykres, który obejmuje wszystkie 800 zdarzeń dla każdego z 12 szczepów bakterii testowanych podczas 48 godzin inkubacji (łącznie 9600 zdarzeń). Każdy szczep bakteryjny jest prezentowany z wyraźnym kolorem. Przedstawiono obliczoną najlepszą linię do oddzielania bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych. W sumie linia zapewniła poprawną interpretację 97% zdarzeń. Odsetek komórek prawidłowo zinterpretowanych dla poszczególnych szczepów został wyhodowany metodą cal i przedstawiono w tabeli 1. Dla E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus, S. aureus , S. agalactiae , S., dys-galactiae i S. uberis, prawie wszystkie komórki ( Ͼ 96%) zostały prawidłowo zinterpretowane w dowolnym czasie inkubacji. Dla B. cereus , P. fl uores – cens i P. putida , Ͼ 93% komórek zostało zinterpretowanych poprawnie po 12 i 24 h inkubacji, podczas gdy po 6 i 48 h inkubacji tylko 75 do 89% komórek zostało zinterpretowanych poprawnie. W tabeli 2 przedstawiono wyniki analiz Flow-cytometrycznych kul poddawanych różnym warunkom przechowywania., Gdy hodowle były przechowywane w temperaturze 5 ° C przez 14 dni, technika barwienia wydawała się być w miarę wieku kultury, szczególnie w przypadku bakterii gram-ujemnych. Średni odsetek prawidłowo zinterpretowanych komórek wynosił 86%. W przypadku E. coli, M. luteus, S. agalactiae, S. dysgalactiae i S. uberis większość komórek ( Ͼ 97%) została prawidłowo zinterpretowana. Dla B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis i S. aureus , 76 do 89% zostało prawidłowo zinterpretowanych, a dla P. fl uorescens i P. putida liczba Fi wynosiła odpowiednio 58 i 68%., Zamrażanie nie zdawało się w technice plam. Po przechowywaniu w temperaturze Ϫ 18 ° C przez 24 h, Ͼ 98% komórek zostało prawidłowo zinterpretowanych dla E. cloacae , E. coli, K. oxy – Toca, L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae i S. uberis . W przypadku B. cereus i P. fl uorescens liczba gości fi wynosiła odpowiednio 83 i 82%. Na rysunku 5 przedstawiono izometryczne wykresy Flow-cytometrycznych anal-yses S. aureus i E. coli dodawanych do mleka zbiornikowego. Dla S. aureus (rys. 5A), 98% zdarzeń było w regionie gram-dodatnim, a 2% zdarzeń weszło w Region gram-ujemny., Dla E. coli (rys. 5B), 96% zdarzeń dotyczyło regionu gram-ujemnego, a 4% zdarzeń dotyczyło regionu gram-dodatniego. Udział naturalnych bakterii obecnych w mleku wynosił mniej niż 0,1%. Dodanie wysokiego stężenia KCl do roztworu do barwienia poprawiło zdolność WGA do barwienia bakterii gram-dodatnich. Możliwe wyjaśnienie jest takie, że bakterie gram-dodatnie mają kwasy teichoic przyłączone prostopadle do ścian komórkowych, co dla niektórych bakterii gram-dodatnich może blokować dostęp WGA do ściany komórkowej., Gdy stężenie KCl jest niskie, struktura kwasów teichoic jest sztywna, ale zwiększając stężenie KCl, struktura zostanie rozluźniona, ponieważ jony potasu eliminują ujemne ładunki na kwasach teichoic, powodując zapadanie się struktury (8, 9). Skład i struktura kwasów teichoic różnią się między gram-dodatnimi spe – cies (24), co może wyjaśniać, dlaczego wzrost koncentracji KCl z 1 do 3 M miał większy wpływ na M. luteus niż na S. uberis . W niniejszej pracy wykorzystano 3 M KCl, aby zmaksymalizować Wiązanie WGA z bakteriami gram-dodatnimi., Techniki eliminacji organizacji kwasów teichoic zostały wcześniej zgłoszone tylko do zastosowań mikroskopowych. Techniki te obejmują stosowanie tetroksydu osmu w wyniku dodawania i odparowywania acetonu (2) oraz podgrzewania bakterii na szkiełku mikroskopowym (29). Nie można jednak brać pod uwagę tych zabiegów w niniejszym badaniu, ponieważ stopień odwodnienia nie jest odpowiedni do cytometrii płowej., Technika barwienia metodą Gram-barwienia wykazała wiarygodne wyniki dla wszystkich szczepów po 6, 12, 24 i 48 h inkubacji, dla których prawie wszystkie (97%) komórki zostały prawidłowo zinterpretowane. Wyniki te są zgodne z wynikami powtórnego przeportowania metody barwienia gramami WGA …