1 Wprowadzenie
integral membrane proteins tworzą dużą część genomów wielu organizmów—około 25% ludzkiego genomu—i pełnią różnorodne funkcje, w tym kluczowe etapy w komunikacji komórki z jej otoczeniem., Ze względu na ich biologiczne i terapeutyczne znaczenie (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), białka błonowe są przedmiotem podstawowych i stosowanych badań biofizycznych w celu scharakteryzowania struktur trójwymiarowych, dynamiki i interakcji w środowiskach podobnych do rodzimych.,
spektroskopia NMR w stanie roztworu odegrała kluczową rolę w badaniach biofizycznych białek membranowych, ponieważ dynamiczne i interakcyjne informacje dostarczane przez takie podejścia ładnie uzupełniają dane strukturalne uzyskane z dyfrakcji rentgenowskiej, cryo-EM i analiz obliczeniowych (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & , Podstawowe dla takich badań są kilka widm 2D „fingerprint”, najczęściej 15N / 1H hsqc (heteronuclear single-quantum coherence) widm (dla szkieletowych amidów plus Trp, Asn i łańcuchów bocznych Gln) lub metylu 13C/1h HMQC (heteronuclear multiple-quantum coherence) widm dla łańcuchów bocznych grup metylowych (Pellecchia et al., 2008). Te eksperymenty ukierunkowane na metyl są szczególnie korzystne dla dużych, powolnych błon białkowych/lipidowych kompleksów; eksperymenty skierowane do innych stron sidechain i mainchain zostały z powodzeniem zastosowane, jak również., Eksperymenty NMR mogą dostarczać informacji o dynamice białek w wielu skalach czasowych, od szybkich (ps–NS) ruchów łańcucha bocznego do powolnych zmian konformacyjnych (µs–ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Wand, Moorman, & , Wiele z tych eksperymentów dynamicznych, często wykorzystujących grupy metylowe łańcucha bocznego jako sondy, zostało zaadaptowanych i opracowanych dla dużych systemów biomolekularnych i może być używanych do białek błonowych (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, &
szczególną zaletą NMR w stanie roztworu jest to, że białka są badane w stanie roztworu natywnego, w którym mogą interkonwertować między wieloma konformacjami., Jednak białka błonowe muszą być rozpuszczone w odpowiedniej membrany mimetycznej, która utrzymuje natywną strukturę i dynamikę. Różne opcje obejmują micele detergentowe, amfipole, bicelle, nanodysky, Smalpy i pęcherzyki lipidowe, z których każdy ma swoje zalety i wady (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Często konieczne jest przetestowanie różnych strategii solubilizacji dla danej próbki białka pod kątem stabilności, intensywności sygnału i rozdzielczości oraz natywnej struktury/aktywności., Dwa ważne względy dla wszystkich membrany mimetyki są (1) jednorodny i mały rozmiar cząstek i (2) wysoki stopień deuteracji.
deuteracja wysokiego poziomu, zarówno w obrębie membrany mimetycznej, jak i samego białka, ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia liczby sygnałów 1h obecnych w widmach (w tym z lipidów, które mogą być intensywne) i poprawy właściwości relaksacyjnych pozostałych spinów aktywnych NMR w próbce., Podczas gdy deuteracja jest możliwa dla membrany mimetycznej poprzez zakup/syntezę związków deuterowanych, zastąpienie 1h przez 2h w białkach wymaga biosyntetycznego włączenia. W przypadku eksperymentów szkieletowych w systemach ekspresji eukariotycznej można jednolicie oznaczać 15N, aby obserwować wszystkie amidy (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) lub poprzez dodanie specyficznie oznaczonych aminokwasów (Isogai et al., 2016)., W przypadku grup metylowych można dostarczyć odpowiednio oznakowanych aminokwasów lub prekursorów aminokwasów (zwłaszcza kwasów alfa-ketonowych) do mediów wzrostu, aby uzyskać dostęp do różnych wzorców etykietowania w łańcuchach bocznych kilku aminokwasów (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind izoleucyna δ1 grupy metylowe szczególnie przydatne biorąc pod uwagę (1) obfitość reszt Ile w integralnych białkach błonowych, w tym GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) przesunięcie daleko w górę 13C grup metylowych izoleucyny δ1, umieszczając je w szczególnie niezakłóconym regionie widma 2D 13C/1H, (3) brak potrzeby stereospecyficznego przypisywania tych grupy metylowe, w przeciwieństwie do Val i leu, oraz (4) obecność wielu, swobodnie obracających się wiązań między grupą metylową a szkieletem białka, zapewniając znaczną niezależność dynamiki w tych miejscach (kasinath et al.,, 2013).
podczas gdy wiele z wyżej wymienionych strategii etykietowania zostały dobrze opracowane dla E. coli, wiele integralnych białek błonowych może być wyrażona tylko na wysokim poziomie w gospodarzach eukariotycznych. Wśród nich metylotroficzne drożdże Pichia pastoris są wygodnym gospodarzem dla ekspresji heterologicznej i znakowania izotopowego eukariotycznych białek błonowych (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Zalety Pichia obejmują szybkość manipulacji genetycznej, wysokie plony rekombinowanego białka, istnienie modyfikacji posttranslacyjnej (PTM) i maszyn opiekuńczych niezbędnych dla eukariotycznych białek błonowych oraz zdolność do wzrostu na zdefiniowanym minimalnym nośniku pozwalającym na perdeuterację (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, & 2000). Jednolite znakowanie izotopowe w Pichia została dobrze ugruntowana (Morgan et al., 2000; Pickford & O ' Leary, 2004)., Rozszerzyliśmy tę pracę, demonstrując etykietowanie 13C, 1H grup metylowych izoleucyny δ1 w perdeuterowanym tle, dodając znakowany α-ketomaślan (~50% etykietowania, ~ 90% deuteru) do wysoce deuterowanych mediów wzrostu (Clark et al., 2017, 2015). W przeciwieństwie do tego, jednoczesne etykietowanie leucyny δ-i waliny γ-metylowych grup z α-ketoizowalerianem jest nieefektywne, ale można je osiągnąć poprzez dodanie znakowanej waliny bezpośrednio do mediów wzrostu lub modyfikowanie warunków hodowli (Clark et al., 2015; Suzuki i in., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia może łatwo pobierać dodatkowe aminokwasy z mediów, z ogólną korelacją między efektywnością wychwytu a kosztami energetycznymi syntezy tego aminokwasu de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Jednak po wchłonięciu do komórek, znakowane aminokwasy mogą być wprowadzane do szlaków metabolicznych (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer,& Szyperski, 2004), rozcieńczając sygnał pożądanych aminokwasów i komplikując analizę danych przez szyfrowanie izotopowe., Alternatywnie, szczepy auksotropowe mogą być opracowywane do znakowania określonego aminokwasu; jednak należy zachować ostrożność, aby potwierdzić, że efekty poza celem w innych szlakach metabolicznych nie powstają (Whittaker, 2007).
tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły potrzebne do wytworzenia takich integralnych białek błonowych znakowanych U-2h (13C, 1h-Ile δ1 metylu) przez nadekspresję w Pichia, przy użyciu ludzkiego receptora adenozyny A2A jako układu modelowego., Szczegółowo opisujemy, w jaki sposób takie próbki mogą być wykorzystywane w badaniach NMR, od pozyskania prostych widm 13C/1H HMQC, poprzez przypisanie zmian chemicznych przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, do analiz 1H-1H pomiarów relaksacji krzyżowej szybkiej dynamiki łańcucha bocznego.