Genetycznie kodowany system bioluminescencyjny z grzybów

• bioluminescencja
• biosynteza lucyferyny grzybowej
• lucyferaza grzybowa

bioluminescencja jest naturalnym zjawiskiem emisji światła wynikającym z utleniania substratu, lucyferyny, katalizowanego przez enzym lucyferazę. Różne gatunki mają charakter bioluminescencyjny (1); dla wielu z nich zdolność do emitowania światła jest cechą charakterystyczną ich biologii (2⇓-4). Sztuczna integracja naturalnych reakcji bioluminescencyjnych z żywymi systemami stała się również narzędziem raportowania szeroko stosowanym w biologii molekularnej i komórkowej (5, 6)., Jednak naturalne systemy bioluminescencyjne pozostają słabo scharakteryzowane na poziomie biochemicznym, ograniczając bardziej powszechne zastosowanie. Opisano tylko 9 rodzin lucyferyn i 7 rodzin genów lucyferazy (7, 8) z co najmniej 40 układów bioluminescencyjnych, które istnieją w przyrodzie (9). Niestety, tylko jedna kaskada biochemiczna zaczynająca się od rozpowszechnionego metabolitu do lucyferyny została opisana w całości (10). Opisywany szlak jest bakteryjny i ma ograniczone zastosowanie u eukariotów (11)., Żaden z eukariotycznych układów bioluminescencyjnych nie został opisany na tyle szczegółowo, aby mógł być wyrażony w innym organizmie lub tworzyć sztuczne autonomicznie organizmy bioluminescencyjne. Tutaj opisujemy funkcję i ewolucję kluczowych genów odpowiedzialnych za bioluminescencję grzyba Neonothopanus nambi i pokazujemy, że ekspresja genów grzyba jest wystarczająca do samodzielnego wytwarzania bioluminescencyjnych eukariotów.

Około 100 gatunków grzybów z rzędu Agaricales emituje światło wykorzystując tę samą reakcję biochemiczną (12)., Chociaż ekologiczna rola ich bioluminescencji nie jest w pełni poznana, istnieją dowody na to, że mogą być one wykorzystywane przez grzyby do przyciągania owadów rozkładających zarodniki (13). Wiadomo, że bioluminescencja grzybów wykorzystuje co najmniej cztery składniki: tlen molekularny; lucyferynę, która została niedawno zidentyfikowana jako 3-hydroksyhispidyna; i dwa wcześniej nieopisane kluczowe enzymy, hydroksylazę zależną od NAD (P)H I lucyferazę (15, 16).

aby zidentyfikować enzymy szlaku bioluminescencyjnego grzybów, najpierw skupiliśmy się na izolacji genu lucyferazy. Wyrażając N., biblioteka nambi cDNA w Pichia pastoris i opryskiwanie płyt agarowych syntetyczną 3-hydroksyhispidyną, zidentyfikowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy luminescencyjną kolonię drożdży wyrażającą Gen luciferazy (dodatek SI, Fig. S1 i S13). Lucyferaza N. nambi, nnLuz, jest białkiem 267-aa (dodatek SI, rys. S2) i nie ma opisanych homologów ani wyraźnego podobieństwa sekwencji do konserwowanych domen białkowych, reprezentujących nową rodzinę białek.

geny kodujące enzymy syntetyzujące metabolity wtórne są często grupowane w genomach grzybów (17)., Postawiliśmy hipotezę, że może tak być w przypadku enzymów kaskady bioluminescencyjnej, ponieważ uważa się, że kaskada jest zachowana wśród grzybów bioluminescencyjnych (12). Szukaliśmy więc genów związanych z biosyntezą lucyferyny w pobliżu genu lucyferazy w genomie N. nambi. Oprócz N. nambi zsekwencjonowaliśmy również genomy i transkryptomy grzybów bioluminescencyjnych Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor i Panellus stipticus i porównaliśmy je z publicznie dostępnymi sekwencjami genomów grzybów bioluminescencyjnych i nonbioluminescencyjnych (18, 19)., Odkryliśmy, że lucyferaza jest członkiem konserwowanego klastra genów, który obejmuje co najmniej dwa inne geny: h3h i hisps (rys. 1 B I C oraz zbiory danych S1–S3).

Gen h3h wykazywał podobieństwo sekwencji do 6-monooksygenaz 3-hydroksybenzoesanu, enzymów katalizujących utlenianie 3-hydroksybenzoesanu przy użyciu nadh i tlenu molekularnego. Reakcja ta jest identyczna z tą, która przekształca hispidynę w lucyferynę (rys. 1A); zatem postawiliśmy hipotezę, że Gen h3h koduje hispidyn-3-hydroksylazę( H3H), enzym odpowiadający przewidywanej hydroksylazy (15)., Sklonowaliśmy Gen Z N. nambi i odkryliśmy, że kolonie P. pastoris wyrażające zarówno nnluz, jak i nnh3h emitują światło po rozpyleniu z hispidyną prekursora lucyferyny, w przeciwieństwie do Kolonii kontrolnych wyrażających sam nnluz (dodatek SI, Fig. S14 i S17) – potwierdzający, że nnH3H zamienia hispidynę w lucyferynę.

Gen hisps (rys. 1C) koduje członka rodziny syntazy poliketydów, enzymy wytwarzające metabolity wtórne w różnych organizmach w całym drzewie życia (20)., Syntazy poliketydów zazwyczaj dodają cząsteczki malonylowe do rosnącego łańcucha węglowego; tak więc α-pironowa natura hispidyny sugerowała, że jej biosynteza może być wykonywana przez syntazę poliketydów z kwasu kawowego przez dwa cykle dodawania jednostek malonylowych, a następnie laktonizację (ryc. 1a i dodatek SI, rys. S3). Duże modularne syntazy poliketydowe wymagają modyfikacji posttranslacyjnych dla swojej aktywności (21), takich jak przeniesienie grupy fosfopanteteinylowej do konserwowanej pozostałości serynowej domeny białka nośnika acylowego., Aby sprawdzić, czy Gen hisps może wytwarzać prekursor lucyferyny w układzie heterologicznym, zintegrowaliśmy geny hisps, nnluz i nnh3h wraz z genem transferazy 4 ' – fosfopanteiny Aspergillus nidulans npga do genomu P. pastoris. Podczas hodowli w środowisku zawierającym kwas kawowy drożdże wyrażające wszystkie cztery geny emitują światło widziane gołym okiem (rys. 3A), podczas gdy nie zaobserwowano istotnej produkcji światła u szczepów pozbawionych genów npgA lub hisps (dodatek SI, Fig. S15 i S17)., W związku z tym hisps katalizuje syntezę hispidyny z kwasu kawowego, zamykając łańcuch reakcji („cykl kwasu kawowego”) ze wspólnego metabolitu komórkowego o znanej biosyntezie do eukariotycznej lucyferyny.

u niektórych gatunków grzybów bioluminescencyjnych klaster genomowy zawiera jeden lub dwa dodatkowe geny (rys. 1C): jeden należący do rodziny cytochromu P450, a drugi należący do rodziny hydrolaz fumaryloacetooctanu., Ten ostatni (cph) prawdopodobnie koduje hydrolazę kofeylopirogronianu (zestaw danych S4) biorącą udział w recyklingu oksylucyferyny, zgodną z kofeylopirogronianem, grzybiczym oksylucyferyną, hydrolizowaną do kofeiny i pirogronianu przez hydrolazę obecną w ekstraktach z grzybów surowych (22).

Konserwacja klastra genów sugeruje, że w przeciwieństwie do innych grup organizmów bioluminescencyjnych (23), bioluminescencja wyewoluowała u grzybów tylko raz, z genami luz, h3h i hisps powstającymi w wyniku duplikacji genów. Zrekonstruowane drzewa filogenetyczne dla genów luz, h3h i HIPS( si, Fig., S4–S6) oraz drzewa gatunkowego rzędu Pieczarkowców (Fig. 2) ujawnić ewolucję kaskady bioluminescencyjnej u grzybów. Główny enzym luz w grzybiczej kaskadzie bioluminescencji powstał w wyniku duplikacji genów u podstaw Agaricales, a następnie duplikacji h3h i Hisp kilka milionów lat później. Co ciekawe, wiele gatunków w dużym kladzie kodujących hisps jest nonbioluminescencyjnych, a homologom hisps u gatunków bioluminescencyjnych brakuje dwóch domen, domen ketoreduktazy i dehydratazy (dodatek SI, rys. S6)., Jest prawdopodobne, że utrata tych domen funkcjonalnych u wspólnego przodka gatunków bioluminescencyjnych sprzyjała produkcji α-pironów przez przodków, prawdopodobnie zapewniając końcowy etap powstawania bioluminescencji.

klaster genów rozwijał się dynamicznie po przejęciu bioluminescencji. Co najmniej sześć niezależnych całkowitej lub częściowej utraty genów genów z klastra genomowego doprowadziło do wtórnej utraty bioluminescencji (rys. 2). Gen cph został wprowadzony do kladu w kladzie niemycenoidów, prawdopodobnie dwukrotnie (rys. 1)., Ten wzór mozaiki przypomina historię ewolucyjną fluorescencyjnych białek (24), innej wizualnie istotnej rodziny białek o niejasnej roli biologicznej i może wskazywać, że selektywna przewaga zapewniona przez bioluminescencję u grzybów zależy od specyficznego lub przejściowego kontekstu ekologicznego.

kompleksowe adaptacje mogą być źródłem rozwiązań istotnych biotechnologicznie., Oprócz ujawnienia natury podstawowych procesów fotochemicznych i ewolucji białek, lucyferazy należą do podstawowych typów genów reporterskich wykorzystywanych w różnych rurociągach badawczych, metodach diagnostyki i zastosowaniach środowiskowych (5, 6, 25). Aby określić, czy grzybowa ścieżka bioluminescencyjna może dostarczyć genów reporterskich, scharakteryzowaliśmy nnLuz in vitro i przetestowaliśmy jego zdolność do wytwarzania światła w układach heterologicznych.

białko nnLuz składa się z 267 aminokwasów i ma masę cząsteczkową około 28,5 kDa (dodatek SI, rys. S7)., Chociaż jego lokalizacja komórkowa in vivo pozostaje nieznana, białko ma przewidywaną N-końcową helisę transmembranową, zgodną z kolokalizacją aktywności lucyferazy z nierozpuszczalnymi frakcjami komórkowymi w poprzednich badaniach (22). Po wyrażeniu w P. pastoris, nnluz był związany z frakcją mikrosomalną (dodatek SI, rys. S8) i emitowane Zielone światło z maksimum w 520 nm i widmo identyczne do N. nambi grzybni (rys. 3a i dodatek SI, rys. S9). Rekombinowany nnLuz emituje światło optymalnie przy około pH 8.,0 i umiarkowanych temperaturach, tracąc swoją aktywność w temperaturach powyżej 30 °C (dodatek SI, rys. S10).

aby sprawdzić potencjał nnluz jako genu reporterskiego w układach heterologicznych, przetestowaliśmy jego ekspresję w Escherichia coli, P. pastoris, wczesnych embrionach Xenopus laevis i komórkach ludzkich., Chociaż lucyferaza gromadzi się głównie w ciałach inkluzji, gdy ulega ekspresji w bakteriach (dodatek SI, rys. S7), wszystkie badane komórki i organizmy wyrażające nnluz typu dzikiego były wyraźnie bioluminescencyjne po dodaniu 3-hydroksyhispidyny do pożywki (rys. 3 I SI Appendix, Fig. S11 i S22). Porównaliśmy również nnluz jakościowo z lucyferazą ze świetlika Photinus pyralis w obrazowaniu całego ciała przeszczepów nowotworowych u myszy. We s.c., wszczepiono równe ilości mysich komórek raka jelita grubego z ekspresją nnluz lub lucyferazy firefly pod tym samym promotorem, wstrzyknięto mieszaninę lucyferyn firefly i grzybiczych i. p. i uzyskano prawie identyczne sygnały z implantów (rys. 3C).

na koniec chcieliśmy sprawdzić, czy biosynteza lucyferyny może być osiągnięta w organizmach pozbawionych biosyntezy kwasu kawowego. Wprowadzenie trzech dodatkowych genów kodujących enzymy biosyntezy kwasu kawowego z tyrozyny, rhodobacter capsulatus amoniaku tyrozyny i dwóch E., coli 4-hydroksyfenylooctan 3-monooksygenazy składniki (26), do genomu szczepu P. pastoris niosącego geny npgA, hisps, h3h i luz spowodowało szczep, który był autonomicznie bioluminescencyjny, gdy uprawiany w standardowym pożywce drożdży (dodatek SI, Fig. S12 i S16).

tak więc, we wszystkich badanych warunkach, lucyferaza typu dzikiego N. nambi działa w układach heterologicznych, pozycjonując się jako obiecujący Gen reporterski, a lucyferyna grzybicza może być syntetyzowana z aminokwasów aromatycznych w innych eukariotach., Ponadto lucyferyna grzybicza jest rozpuszczalnym w wodzie i przepuszczalnym dla komórek związkiem, a jej reakcja emitowania światła nie zależy od dostępności ATP, dzięki czemu grzybowy system bioluminescencyjny jest atrakcyjny dla wielu zastosowań w obrazowaniu biomedycznym. Ponadto różne analogi lucyferyny mogą być stosowane w celu zwiększenia emisji światła i dostrojenia widma, poprawiając penetrację światła w aplikacjach obrazowania tkanek głębokich (22).

podsumowując, przedstawiamy kaskadę enzymatyczną prowadzącą do emisji światła u grzybów, która jest eukariotycznym układem bioluminescencyjnym ze znaną biosyntezą lucyferyny., Wykazaliśmy, że lucyferina jest syntetyzowana z prekursora hispidyny przez N. nambi H3H i że hispidyna może być bezpośrednio syntetyzowana przez syntazę hispidyny z kwasu kawowego, szeroko rozpowszechnionego metabolitu komórkowego o wydajnej biosyntezie, która została osiągnięta w różnych organizmach, w tym przemysłowych istotnych szczepów drożdży (26)., Tylko dwa enzymatyczne kroki od głównego nurtu szlaków metabolicznych, system grzybiczy ma wysoki potencjał syntetycznej biologii do tworzenia autonomicznie świecących zwierząt i roślin: próby rozwoju takich organizmów były do tej pory ograniczone przez słabą wydajność w eukariotów bakteryjnego systemu bioluminescencyjnego, jedyny system, dla którego znana była biosynteza lucyferyny (27, 28).

odtworzenie grzybowego szlaku bioluminescencyjnego u organizmów eukariotycznych może umożliwić zastosowanie, w którym tkanki lub organizmy zgłaszają zmiany w swoim stanie fizjologicznym z autonomiczną emisją światła., Może to również przyspieszyć rozwój nowej generacji architektury organicznej (29), w której genetycznie zmodyfikowane jarzące się rośliny zostaną zintegrowane z budynkami i infrastrukturą miejską. Poza tym, ze swoją intrygującą historią ewolucyjną, rodziną lucyferaz i ogólną prostotą, przedstawiony tu system bioluminescencyjny grzybów jest molekularnym placem zabaw, posiadającym wiele możliwości dla badań podstawowych i stosowanych.,