1 Inleiding
Integral membraanproteïnen maken een groot deel uit van de genomen van vele organismen—ongeveer 25% van het menselijk genoom—en vervullen een breed scala aan functies, waaronder belangrijke stappen in de communicatie van een cel met zijn omgeving., Vanwege hun biologische en therapeutische belang (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), zijn membraaneiwitten de focus van fundamenteel en toegepast biofysisch onderzoek om driedimensionale structuren, dynamiek en interacties in native-like omgevingen te karakteriseren.,
Oplossingstoestand NMR-spectroscopie heeft een cruciale rol gespeeld in biofysische studies met membraaneiwit, aangezien de site-specific dynamic and interaction information provided by such approaches nice completed structural data obtained from X-ray diffraction, cryo-EM, and computational analyses (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Fundamenteel voor dergelijke studies zijn verschillende 2D “fingerprint spectra,” meestal 15N / 1H hsqc (heteronuclear single-quantum coherence) spectra (voor backbone amide plus Trp, Asn, en Gln sidechains) of methyl 13C/1H HMQC (heteronuclear multiple-quantum coherence) spectra voor sidechain methylgroepen (Pellecchia et al., 2008). Deze methyl-gerichte experimenten zijn vooral voordelig voor grote, langzaam-tuimelende membraanproteã ne/lipidencomplexen; experimenten die aan andere sidechain en mainchainplaatsen worden gericht zijn ook met succes toegepast., NMR–experimenten kunnen informatie verschaffen over eiwitdynamiek over vele tijdschalen, van snelle (ps–ns) sidechain-bewegingen tot langzame conformationele veranderingen (µs-ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Wand, Moorman, & Harpole, 2013)., Veel van deze dynamicsexperimenten, vaak met behulp van sidechain methylgroepen als probes, zijn aangepast en ontwikkeld voor grote biomoleculaire systemen en kunnen worden gebruikt voor membraaneiwitten (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
een bijzonder voordeel van oplossing-toestand NMR is dat de proteã nen in een native-like oplossingstoestand worden bestudeerd waar zij tussen veelvoudige conformaties kunnen interconverteren., Nochtans, moeten membraanproteã nen in een geschikt membraanimetic worden opgelost dat inheemse structuur en dynamiek handhaaft. Verschillende opties zijn wasmiddel micelles, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, en lipide blaasjes, elk met hun eigen voor-en nadelen (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Het is vaak noodzakelijk om verschillende oplosbaarheidsstrategieën voor een bepaalde eiwitsteekproef voor stabiliteit, signaalintensiteit en resolutie, en inheemse structuur/activiteit te testen., Twee belangrijke overwegingen voor alle membraanmimetica zijn (1) een uniforme en kleine deeltjesgrootte en (2) een hoge mate van deuteratie.
deuteratie op hoog niveau, zowel binnen het mimetische membraan als binnen het eiwit zelf, is van cruciaal belang om het aantal 1H-signalen in spectra (inclusief die van lipiden, die intens kunnen zijn) te verminderen en om de relaxatiekarakteristieken van de resterende NMR-actieve spins in het monster te verbeteren., Terwijl deuteratie mogelijk is voor het membraan mimetisch door de aankoop/synthese van deuterated samenstellingen, vereist het vervangen van 1H door 2H in proteã nen biosynthetische integratie. Voor backbone experimenten in eukaryotische expressiesystemen, kan men uniform labelen met 15N om alle amiden (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) of door toevoeging van specifiek gelabelde aminozuren (Isogai et al., 2016)., Voor methylgroepen, kan men of aangewezen geëtiketteerde aminozuren of aminozuurprecursoren (in het bijzonder alpha — keto zuren) aan groeimedia verstrekken om diverse etiketteringspatronen in de zijkanten van verscheidene aminozuren (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucine δ1 methyl groepen die in het bijzonder nuttig gezien (1) de overvloed van Ile residuen in de integrale membraaneiwitten met inbegrip van GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) de ver hoogland 13C verschuiving van isoleucine δ1 methyl groepen , waardoor ze in een bijzonder rustige streek van 2D-13C/1H spectra, (3) het gebrek aan noodzaak om stereospecifically toewijzen deze methyl groepen, in tegenstelling tot de Val en Leu, en (4) de aanwezigheid van meerdere, vrij draaibare banden tussen de methyl-groep en eiwit ruggengraat, bieden aanzienlijke onafhankelijkheid van de dynamiek op deze locaties (Kasinath et al.,, 2013).
hoewel veel van de bovengenoemde etiketteringsstrategieën goed ontwikkeld zijn voor E. coli, kunnen veel geïntegreerde membraaneiwitten alleen op hoge niveaus in eukaryotische gastheren tot expressie worden gebracht. Onder deze, is de Methylotrofe gist Pichia pastoris een geschikte gastheer voor heterologe uitdrukking en isotopische etikettering van eukaryotic membraanproteã nen (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Voordelen van Pichia zijn snelheid van genetische manipulatie, een hoge opbrengst van recombinant eiwit, het bestaan van posttranslational wijziging (PTM) en begeleider machines die nodig zijn voor eukaryotische membraan eiwitten, en het vermogen om te groeien op gedefinieerde minimale media waardoor perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Uniforme isotopische etikettering in Pichia is goed vastgesteld (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‘ Leary, 2004)., We hebben dit werk uitgebreid door de 13C, 1H labeling van isoleucine δ1-methyl groepen in een perdeuterated achtergrond aan te tonen door geëtiketteerd α-ketobutyraat (~ 50% labeling, ~ 90% deuteration) toe te voegen aan sterk deuterated groeimedia (Clark et al., 2017, 2015). Daarentegen is het gelijktijdig etiketteren van leucine δ – en valine γ-methylgroepen met α-ketoisovaleraat inefficiënt, maar kan worden bereikt door geëtiketteerde valine rechtstreeks aan de groeimedia toe te voegen of de kweekomstandigheden te wijzigen (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia kan gemakkelijk extra aminozuren uit media opnemen, met een algemene correlatie tussen opnamecapaciteit en de energetische kosten om dat aminozuurtype de novo te synthetiseren (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Na opname in cellen kunnen geëtiketteerde aminozuren echter in metabole routes worden ingevoerd (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), waarbij het signaal van gewenste aminozuren wordt verdund en gegevensanalyse wordt bemoeilijkt door isotopische scrambling., Als alternatief kunnen auxotrofe stammen worden ontwikkeld voor het etiketteren van een specifiek aminozuur; er moet echter op worden gelet dat er geen neveneffecten in andere metabole routes optreden (Whittaker, 2007).
Hier bieden we gedetailleerde protocollen die nodig zijn om dergelijke U-2H (13C, 1H-Ile δ1 methyl)-gelabelde integrale membraanproteã nen door overexpressie in Pichia te genereren, gebruikend de menselijke adenosine A2A receptor als modelsysteem., We gaan verder in op de manier waarop dergelijke monsters kunnen worden gebruikt in oplossingen NMR studies, van het verkrijgen van eenvoudige 13C / 1H hmqc spectra, via chemische shift toewijzingen Door site-directed mutagenese, tot analyses van 1H-1H cross-relaxatie metingen van snelle sidechain dynamica.