Genetisch Codeerbaar bioluminescent systeem van schimmels

• bioluminescentie
• schimmelluciferine biosynthese
• schimmelluciferase

bioluminescentie is een natuurlijk verschijnsel van lichtemissie als gevolg van oxidatie van een substraat, luciferine, gekatalyseerd door een enzym, luciferase. Een verscheidenheid aan soorten zijn bioluminescent van aard (1); voor velen van hen is het vermogen om licht uit te zenden een bepalende eigenschap van hun biologie (2⇓-4). Kunstmatige integratie van natuurlijke bioluminescente reacties in levende systemen is ook uitgegroeid tot een rapportage instrument op grote schaal gebruikt in moleculaire en celbiologie (5, 6)., Nochtans, blijven de natuurlijke bioluminescente systemen slecht gekenmerkt op een biochemisch niveau, beperkend wijdverspreide toepassing. Er zijn slechts 9 luciferinen en 7 luciferase-genfamilies beschreven (7, 8) van ten minste 40 bioluminescente systemen waarvan wordt aangenomen dat ze in de natuur bestaan (9). Het is betreurenswaardig dat slechts één enkele biochemische cascade die begint van een wijdverspreide metaboliet tot een luciferine in zijn geheel is beschreven (10). De beschreven weg is bacterieel en heeft beperkte toepassing in eukaryotes (11)., Geen van de eukaryotische bioluminescente systemen is voldoende gedetailleerd beschreven om tot expressie te komen in een ander organisme of om kunstmatig autonoom bioluminescente organismen te creëren. Hier beschrijven we de functie en evolutie van de sleutelgenen die verantwoordelijk zijn voor de bioluminescentie van de schimmel Neonothopanus nambi en laten we zien dat de expressie van schimmelgenen voldoende is om autonoom bioluminescente eukaryoten te ontwikkelen.

Ongeveer 100 schimmelsoorten uit de orde Agaricales stralen licht uit met behulp van dezelfde biochemische reactie (12)., Hoewel de ecologische rol van hun bioluminescentie niet volledig wordt begrepen, zijn er aanwijzingen dat het door schimmels kan worden gebruikt om sporenverdelende insecten aan te trekken (13). Schimmel bioluminescentie was bekend om ten minste vier componenten te gebruiken: moleculaire zuurstof; de luciferine, die onlangs werd geïdentificeerd als 3-hydroxyhispidin ; en twee eerder onbeschreven sleutelenzymen, een nad(P)H-afhankelijke hydroxylase en een luciferase (15, 16).

om enzymen van de fungale bioluminescente route te identificeren, richtten we ons eerst op isolatie van het luciferasegen. Door de N. uit te drukken., nambi cDNA bibliotheek in Pichia pastoris en het spuiten van agarplaten met synthetische 3-hydroxyhispidin, identificeerden en sequenced een luminescente gistkolonie expressie van het luciferase gen (SI Appendix, vijgen. S1 en S13). De N. nambi luciferase, nnLuz, is een 267-aa eiwit (SI Appendix, Fig. S2) en heeft geen beschreven homologen of uitgesproken opeenvolgings gelijkenis met geconserveerde eiwitdomeinen, die een nieuwe eiwitfamilie vertegenwoordigen.

genen die coderen voor enzymen die secundaire metabolieten synthetiseren, zijn vaak geclusterd in schimmelgenomen (17)., We veronderstelden dat dit het geval zou kunnen zijn voor enzymen van de bioluminescente cascade, omdat men denkt dat de cascade bewaard wordt onder de bioluminescente schimmels (12). We zochten dus naar genen gerelateerd aan luciferine biosynthese in de omgeving van het luciferase gen in het N. nambi genoom. Naast N. nambi sequentieerden we ook genomen en transcriptomen van bioluminescente schimmels Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor en Panellus stipticus en vergeleken ze met publiek beschikbare genoomsequenties van bioluminescente en niet-bioluminescente schimmels (18, 19)., We vonden dat luciferase een lid is van een geconserveerde gencluster, die minstens twee andere genen omvat: h3h en hisps (Fig. 1 B en C en Datasets S1–S3).

het H3H-gen vertoonde sequentiegelijkenissen met 3-hydroxybenzoaat 6-mono-oxygenasen, enzymen die de oxidatie van 3-hydroxybenzoaat katalyseren met NADH en moleculaire zuurstof. Deze reactie is identiek aan die welke hispidin omzet in luciferine (Fig. 1A); zo veronderstelden we dat H3H gen codeert voor hispidin-3-hydroxylase (H3H), het enzym dat overeenkomt met de voorspelde hydroxylase (15)., Wij kloonden het gen van N. nambi en vonden dat de kolonies van P. pastoris die zowel nnluz als nnh3h uitdrukken licht uitzenden wanneer bespoten met luciferin precursor hispidin, in tegenstelling tot controlekolonies die alleen nnluz uitdrukken (si bijlage, vijgen. S14 en S17) – bevestigend dat nnh3h hispidin in luciferin omzet.

het hisps-gen (Fig. 1C) codeert voor een lid van de polyketidesynthasefamilie, enzymen die secundaire metabolieten produceren in een verscheidenheid aan organismen in de levensboom (20)., Polyketidesynthasen voegen doorgaans malonyldelen toe aan de groeiende koolstofketen; De α-pyronaard van hispidin suggereert dus dat de biosynthese kan worden uitgevoerd door een polyketidesynthase uit cafeïnezuur door twee cycli van toevoeging van malonyleenheden gevolgd door lactonisatie (Fig. 1A en Si bijlage, Fig. S3). Grote modulaire polyketidesynthases vereisen posttranslationele wijzigingen voor hun activiteit (21), Zoals de overdracht van een fosfopantetheinylgroep aan een geconserveerd serineresidu van het acyl-dragereiwitdomein., Om te testen of het hisps-gen luciferine-precursor in een heteroloog systeem kan produceren, integreerden we hisps -, nnluz-en nnh3h-genen samen met het Aspergillus nidulans 4′ – fosfopantetheinyltransferase-gen NPGA in het genoom van P. pastoris. Wanneer gekweekt in een medium met cafeïnezuur, gisten expressie van alle vier de genen uitgezonden licht gezien met het blote oog (Fig. 3A), terwijl er geen significante lichtproductie werd waargenomen bij stammen zonder NPGA-of hisps-genen (SI Appendix, Fig ‘ s. S15 en S17)., Daarom katalyseert hisps de synthese van hispidin uit cafeïnezuur, waardoor de keten van reacties (de “cafeïnezuurcyclus”) van een gemeenschappelijke cellulaire metaboliet met bekende biosynthese tot een eukaryotisch luciferine wordt gesloten.

in sommige bioluminescente schimmelsoorten herbergt de genomische cluster één of twee extra genen (Fig. 1C): één behorend tot de cytochroom P450-familie, en de andere behorend tot de familie van fumarylacetoacetaathydrolasen., Deze laatste (cph) codeert waarschijnlijk een caffeylpyruvaathydrolase (Dataset S4) die betrokken is bij oxyluciferine-recycling, in overeenstemming met caffeylpyruvaat, het schimmeloxyluciferine, dat wordt gehydrolyseerd tot caffeaat en pyruvaat door een hydrolase aanwezig in schimmel ruwe extracten (22).

behoud van de gencluster suggereert dat, in tegenstelling tot andere groepen bioluminescente organismen (23), bioluminescentie slechts één keer in schimmels is geëvolueerd, met luz -, h3h-en hisps-genen die ontstaan door genduplicaties. Gereconstrueerde fylogenetische bomen voor luz, h3h, en hisps genen (SI Appendix, vijgen., S4–S6) en de soort boom van de orde Agaricales (Fig. 2) onthullen de evolutie van de bioluminescentie cascade in schimmels. Het primaire Luz-enzym van de schimmelbioluminescentiecascade ontstond door een genduplicatie aan de basis van Agaricales, gevolgd door de duplicatie van h3h en hisps een paar miljoen jaar later. Interessant is dat veel soorten in een grote clade die hisps coderen niet Bioluminescent zijn, en de hisps-homologen in bioluminescente soorten missen twee domeinen, de ketoreductase en dehydratase domeinen (SI Appendix, Fig. S6)., Het is waarschijnlijk dat het verlies van deze functionele domeinen in de gemeenschappelijke voorouder van bioluminescente soorten de productie van α-pyrones door voorouderlijke hisps beviel, wat mogelijk de laatste stap vormde voor het ontstaan van bioluminescentie.

De gencluster bleef dynamisch evolueren na de verwerving van bioluminescentie. Ten minste zes onafhankelijke volledige of gedeeltelijke gebeurtenissen van het genverlies van genen van de genomische cluster leidden tot secundair verlies van bioluminescentie (Fig. 2). Het CPH gen werd in de cluster in de niet-mycenoïde clade ingebracht, mogelijk tweemaal (Fig. 1)., Dit mozaïekpatroon lijkt op evolutionaire geschiedenis van fluorescente proteã nen (24), een andere visueel relevante eiwitfamilie met een onduidelijke biologische rol, en kan erop wijzen dat het selectieve voordeel dat door bioluminescentie in schimmels wordt verstrekt van een specifieke of voorbijgaande ecologische context afhangt.

complexe aanpassingen kunnen een bron van biotechnologisch relevante oplossingen zijn., Naast het openbaren van de aard van fundamentele fotochemische processen en eiwitevolutie, behoren luciferases tot de primaire types van verslaggeversgenen die in diverse onderzoekpijpleidingen, methodes van diagnostiek, en milieutoepassingen worden gebruikt (5, 6, 25). Om te bepalen of een schimmel bioluminescente route reporter genen kan leveren, hebben we nnluz in vitro gekarakteriseerd en het vermogen ervan getest om licht te produceren in heterologe systemen.

het nnluz-eiwit bestaat uit 267 aminozuren en heeft de molecuulmassa van ongeveer 28,5 kDa (SI Appendix, Fig. S7)., Hoewel de cellulaire lokalisatie in vivo onbekend blijft, heeft het eiwit een voorspelde n-terminale transmembrane helix, consistent met colokalisatie van luciferaseactiviteit met onoplosbare celfracties in eerdere studies (22). Wanneer uitgedrukt in P. pastoris, werd nnLuz geassocieerd met de microsomale fractie (SI Appendix, Fig. S8) en groen licht met een maximum bij 520 nm en spectrum identiek aan dat van N. nambi mycelium (Fig. 3A en SI bijlage, Fig. S9). Recombinant nnluz straalt licht optimaal uit bij ongeveer pH 8.,0 en matige temperaturen, die hun activiteit verliezen bij temperaturen boven 30 °C (SI Appendix, Fig. S10).

om het potentieel van nnluz als reportergen in heterologe systemen te testen, hebben we de expressie ervan getest in Escherichia coli, P. pastoris, vroege embryo ‘ s van Xenopus laevis en menselijke cellen., Hoewel luciferase meestal geaccumuleerd in inclusie lichamen wanneer uitgedrukt in bacteriën (SI Appendix, Fig. S7), waren alle geteste cellen en organismen met expressie van wild-type nnluz duidelijk bioluminescent wanneer 3-hydroxyhispidine aan het medium werd toegevoegd (Fig. 3 en SI Appendix, Fig. S11 en S22). We hebben nnLuz ook kwalitatief vergeleken met de luciferase van de firefly Photinus pyralis in een beeldvormingsopstelling van tumor xenografts bij muizen. We s.c., geïmplanteerd gelijke hoeveelheden muriene colon carcinoom cellen expressie van nnluz of firefly luciferase onder dezelfde promotor, geïnjecteerd een mengsel van firefly en schimmel luciferines i. p., en verkregen bijna identieke signalen van de implantaten (Fig. 3C).

ten slotte hebben we geprobeerd te testen of luciferine biosynthese kan worden bereikt in organismen zonder cafeïnezuur biosynthese. Introductie van drie extra genen die coderen voor enzymen van cafeïnezuurbiosynthese uit tyrosine, Rhodobacter capsulatus tyrosine ammoniak lyase en twee E., coli 4-hydroxyfenylacetaat 3-monooxygenase componenten (26), in het genoom van P. pastoris stam dragen NPGA, hisps, h3h, en luz genen resulteerde in een stam die autonoom bioluminescent was wanneer gekweekt in een standaard gistmedium (SI Appendix, vijgen. S12 en S16).

onder alle geteste omstandigheden is wild-type N. nambi luciferase dus functioneel in heterologe systemen en positioneert zich als een veelbelovend reportergen, en schimmelluciferine kan worden gesynthetiseerd uit aromatische aminozuren in andere eukaryoten., Bovendien is schimmelluciferin een in water oplosbare en cel-permeabele samenstelling, en zijn licht-emitterende reactie is niet afhankelijk van de beschikbaarheid van ATP, makend het schimmelbioluminescent systeem aantrekkelijk voor talrijke toepassingen in Biomedische Weergave. Voorts kunnen diverse luciferin-analogen worden gebruikt om lichte emissie te verbeteren en zijn spectra af te stemmen, die lichte penetratie in diepe Toepassingen van de weefselweergave verbeteren (22).tot slot presenteren we de enzymatische cascade die leidt tot lichtemissie in schimmels, een eukaryotisch bioluminescentiesysteem met bekende biosynthese van luciferine., We hebben aangetoond dat luciferine wordt gesynthetiseerd uit zijn precursor hispidin door N. nambi H3H en dat hispidin direct gesynthetiseerd kan worden door hispidin synthase uit cafeïnezuur, een wijdverspreide cellulaire metaboliet met efficiënte biosynthese die werd bereikt in verschillende organismen, waaronder industrieel relevante giststammen (26)., Slechts twee enzymatische stappen verwijderd van de reguliere metabolische routes, heeft het schimmelsysteem een hoog potentieel voor synthetische biologie om autonoom gloeiende dieren en planten te creëren: pogingen om dergelijke organismen te ontwikkelen zijn tot nu toe beperkt door de slechte prestaties in eukaryoten van het bacteriële bioluminescente systeem, het enige systeem waarvoor luciferine biosynthese bekend was (27, 28).

reconstitutie van de bioluminescente route van schimmels in eukaryotische organismen kan toepassingen mogelijk maken waarbij weefsels of organismen veranderingen in hun fysiologische toestand melden met autonome lichtemissie., Het kan ook een impuls geven aan de ontwikkeling van de volgende generatie organische architectuur (29), waarbij genetisch gemodificeerde gloeiende planten zullen worden geïntegreerd in gebouwen en stadsinfrastructuur. Afgezien van dat, met zijn intrigerende evolutionaire geschiedenis, een familie van luciferases, en algemene eenvoud, het schimmel bioluminescente systeem hier gepresenteerd is een moleculaire speeltuin met tal van mogelijkheden voor fundamenteel en toegepast onderzoek.,