… gebaseerd BACTOSCAN FC, dat ethidiumbromide gebruikt om bacteriën in melk te vlekken, levert een resultaat na 8 min (5, 30). Een flow – cytometrische techniek voor het meten van TBC in rauwe en ultrahoge temperatuur melk met de vlek SYTO BC is ook eerder beschreven (16). Nochtans, zijn deze technieken of zeer specifiek, het ontdekken van één species slechts, of niet specifiek, het ontdekken van alle bacteriën., Flow-cytometrische technieken voor differentiatie van bacteriën in melk in grotere groepen zoals gram-positieve en gram-negatieve bacteriën zijn nog niet beschreven. Gramkleuring werd aanvankelijk beschreven in 1883 door Christian Gram ‘ collega Carl Friedlander, waarbij bacteriën in twee groepen werden verdeeld, en opnieuw in 1884 door Christian Gram (12, 14). De conventionele Gramkleurprocedure omvat de vlekken kristalviolet en safranine. Warmte-vaste cellen op een dia zijn gekleurd blauw-violet met kristal violet, en daarna worden ze behandeld met ethanol., Gramnegatieve bacteriën worden ontkleurd door ethanol, terwijl grampositieve bacteriën gekleurd blijven met kristalviolet. Hierna wordt safranine gebruikt om gramnegatieve bacteriën tegen te gaan, waardoor deze groep een roze uiterlijk krijgt. Talrijke alternatieve benaderingen om de Gramreactie te identificeren zijn gemeld. Een methode waarbij een kolonie bacteriën wordt onderworpen aan 3% kaliumhydroxide wordt veel gebruikt. De hoge concentratie van kaliumhydroxide lyses gramnegatieve bacteriën, het vrijgeven van DNA uit de cellen, die kan worden bevestigd door het trekken van een viskeuze snaar uit de kolonie (15, 26)., Een alternatieve Gramkleuringstechniek met een fluoresceïne-geconjugeerd lectine tarwekiem agglutinine (WGA) voor gecombineerde epifluorescentie en een fase – contrastmicroscoop is beschreven (29). WGA bindt aan N – acetylglucosamine in de PEP-tidoglycaanlaag van de celwand. Gramnegatieve bacteriën hebben een laag lipopolysaccharide die de celwand bedekt en daarom zijn ze niet bevlekt met WGA, terwijl grampositieve bacteriën bevlekt zijn met WGA, omdat ze geen lipopolysaccharidelaag hebben., Deze resultaten toonden een ongevoeligheid aan de leeftijd van de cultuur aan die impliceerde dat deze vlek direct op steekproeven zonder precultivation van de steekproef kon worden gebruikt. Een aangepaste versie van de WGA techniek is beschreven voor bacteriën gevonden in een nonfood omgeving waarin de bacteriën worden geïmmobiliseerd op een fi lter, gewassen, en vervolgens gekleurd met WGA (11). Sommige gramkleuring technieken voor fl ow cytometry zijn ook voorgesteld. Men gebruikt de fluorescent lipofiele vlek rho-damine 123, die selectief grampositieve bacteriën bevlekt., De lipopolysaccharidelaag van gramnegatieve bacteriën pre-vents de ingang van rhodamine 123 (1, 28). Een andere gelijkaardige techniek combineert de twee fluorescente DNA-bindende vlekken, SYTO 13 en hexidium jodide (HI). SYTO 13 is een membraandoorlatende vlek, en HI wordt geblokkeerd door de lipopolysaccharidelaag van gramnegatieve bacteriën en dus alleen doorlatend voor grampositieve bacteriën en gramnegatieve bacteriën met een gedestabiliseerde lipopolysaccharidelaag (22). Nochtans, wegens de fragiele aard van de lipopolysaccharidelaag, worden deze technieken verondersteld niet om geschikt voor niet gecultiveerde steekproeven te zijn., Het doel van het huidige werk is geweest om een gramkleuring techniek te ontwikkelen die op het bevlekken van bacteriën met WGA en HI wordt gebaseerd en door fl ow cytometrische opsporing wordt gevolgd. De techniek werd geëvalueerd op melkgeassocieerde bacteriën (19, 20) in de Sta – tionaire fase en na 6, 12 en 48 uur incubatie in laboratoriummedia. Bovendien werd de methode getest op kweekjes in de stationsfase, die gedurende 24 uur bij Ϫ 18 ° C en gedurende 14 dagen bij 5 ° C waren bewaard. tenslotte werd de techniek toegepast op melk in bulktanks die met bekende bacteriën was verrijkt., Een techniek voor differentiatie van grampositieve en gramnegatieve bacteriën in bulk tankmelk zonder precultivering zal de ultieme ap-plicatie zijn. Figuur 1 toont het effect van de KCL-concentratie op de binding van WGA aan de gram-positieve bacteriën M. luteus en S. uberis , wanneer de bacteriën alleen door WGA gekleurd zijn, met uitzondering van HI. In de histogrammen wordt de ruis aan de linkerkant gezien, waar gebeurtenissen met een lage fluorescentie intensiteit zich hebben opgehoopt (een thresh – oude werd gebruikt om het grootste deel van het lawaai weg te snijden)., Wanneer bacteriën worden bevlekt om ze te onderscheiden van lawaai, zullen ze verschijnen als een piek volledig gescheiden van lawaai. Met behulp van 0 M KCl, geen van de twee bacteriën waren gekleurd genoeg om ze te scheiden van het lawaai. Bij gebruik van 1 M KCl werd voor beide bacteriën een verhoogde concentratie waargenomen. De Heer luteus werd toen gescheiden van het lawaai, en S. uberis slechts iets over – likte het lawaai. Het verhogen van de KCL-concentratie tot 3 M verbeterde de binding (hogere fluorescentie-intensiteit) van WGA aan deze bacteriestammen, met name voor M. luteus ., Microscopische waarnemingen toonden aan dat grampositieve bacteriën gekleurd waren door WGA, terwijl gramnegatieve bacte-ria niet gekleurd waren door WGA. HI bevlekte zowel de gram-positieve als de gram-negatieve bacteriën. Figuur 2 toont een voorbeeld van de kleuring van een mengsel (1:1) van de gram-positieve M. luteus en de gram-negatieve E. coli met zowel WGA als HI. Als gevolg van de kleuring, M. luteus verscheen met een groen oppervlak (WGA) en een rood cytoplasma (HI), terwijl E. coli alleen verscheen met een rood cytoplasma. Isometrische plots van fl ow cytometrische analyses van culturen van E. coli, M., luteus, en een mengsel (1: 1) hiervan zijn weergegeven in Fig. 3. Meting van E. coli alleen (Fig. 3A), was 100% van de bijwerkingen aanwezig in het gramnegatieve gebied. Voor M. luteus alleen (Fig. 3B), was 99% van de voorvallen in het gram-positieve gebied en kwam 1% van de voorvallen in het gram-negatieve gebied. Wanneer culturen van E. coli en M. luteus werden gemengd (Fig. 3C), werd 50% van de bijwerkingen waargenomen in elke regio. Elk van de 12 bacteriestammen werd na 6,12, 24 en 48 uur incubatie in duplo gemeten. Van elke meting werden 100 gebeurtenissen gebruikt voor berekeningen. In Fig., 4 Er wordt een samengesteld perceel gepresenteerd dat alle 800 gebeurtenissen omvat voor elk van de 12 bacteriestammen die gedurende 48 uur van incubatie zijn getest (in totaal 9.600 gebeurtenissen). Elke bacteriële stam wordt gepresenteerd met een verschillende kleur. Een berekende beste lijn voor het scheiden van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën wordt getoond. In het algemeen zorgde de regel ervoor dat 97% van de gebeurtenissen correct werd geïnterpreteerd. De percentages cellen die correct werden geïnterpreteerd voor de individuele stammen werden berekend en worden weergegeven in Tabel 1. Voor E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus, S. aureus, S. agalactiae, S., dys-galactiae, en S. uberis, bijna alle cellen (Ͼ 96%) werden correct geïnterpreteerd voor elke incubatietijd. Voor B. cereus , P. fl uores – cens en P. putida werd 93% van de cellen correct geïnterpreteerd na 12 en 24 uur incubatie , terwijl na 6 en 48 uur incubatie slechts 75 tot 89% van de cellen correct werden geïnterpreteerd. In Tabel 2 worden de resultaten van fl ow-cytometrische analyses van cul – turen die aan verschillende opslagomstandigheden worden onderworpen, weergegeven., Wanneer de culturen gedurende 14 dagen bij 5 ° C werden opgeslagen, leek de kleuringtechniek te worden beïnvloed door de leeftijd van de cultuur, vooral voor gramnegatieve bacteriën. Het gemiddelde percentage correct geà nterpreteerd cellen was 86%. Voor E. coli, M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae en S. uberis werden de meeste cellen ( Ͼ 97%) correct geïnterpreteerd. Voor B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis en S. aureus werden 76 tot 89% correct geïnterpreteerd , en voor P. fl uorescens en P. putida waren de cijfers respectievelijk 58 en 68%., Het invriezen bleek de vlektechniek niet te beïnvloeden. Na bewaring bij Ϫ 18 ° C gedurende 24 uur werd 98 98% van de cellen correct geïnterpreteerd voor E. cloacae, E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae en S. uberis . Voor B. cereus en P. fl uorescens waren de cijfers respectievelijk 83 en 82%. Figuur 5 toont de isometrische plots van fl ow-cytometrische anale – yses van S. aureus en E. coli toegevoegd aan bulk tank melk. Voor S. aureus (vijg. 5A), bevond 98% van de voorvallen zich in het gram-positieve gebied en kwam 2% van de voorvallen in het gram-negatieve gebied., Voor E. coli (Fig. 5B), was 96% van de voorvallen in het gramnegatieve gebied en kwam 4% van de voorvallen in het grampositieve gebied. De bijdrage van de natuurlijke bacteriën in de melk was minder dan 0,1%. De toevoeging van een hoge concentratie KCl aan de kleuringsoplossing verbeterde het vermogen van WGA om grampositieve bacteriën te bevlekken. Een mogelijke verklaring is dat grampositieve bacteriën teichoëzuur hebben dat loodrecht op hun celwanden is bevestigd, wat voor sommige grampositieve bacteriën de toegang van WGA tot de celwand kan blokkeren., Wanneer de concentratie van KCl laag is, is de structuur van de teichoëzuur stijf, maar door de concentratie van KCl te verhogen, wordt de structuur losgemaakt als de kaliumionen de negatieve ladingen op de teichoëzuur elimineren, waardoor de structuur instort (8, 9). De samenstelling en structuur van teichoëzuur variëren tussen gram-positieve spe – cies (24), wat kan verklaren waarom een toename van de KCL – concentratie van 1 tot 3 M een groter effect had op M. luteus dan op S. uberis . In het huidige werk werd 3 M KCl gebruikt om de binding van WGA aan grampositieve bacteriën te maximaliseren., Technieken voor de eliminatie van de organisatie van de teichoëzuur zijn voorheen alleen gemeld voor microscopische toepassingen. Deze technieken omvatten het gebruik van osmiumtetroxide – fixatie door toevoeging en verdamping van aceton (2) en verhitting van bacteriën op een microscopisch dia (29). Nochtans, konden deze behandelingen niet in de huidige studie worden overwogen, aangezien een dehydratatiestap cytometry voor fl ow niet geschikt is., De Gramkleuringstechniek toonde betrouwbare resultaten voor alle stammen na 6, 12, 24 en 48 uur incubatie, waarvoor bijna alle (97%) cellen correct werden geïnterpreteerd. Deze resultaten komen overeen met de resultaten van de WGA-Gramkleuringsmethode…