Charcoal-stripped foetaal kalfserum (zie ook Ref. 3)
1
voeg 250 mg houtskool en 25 mg Dextran T-70 toe aan 100 ml foetaal kalfsserum (FCS).incubeer gedurende 30 minuten bij 56°C.
3
centrifugeer bij 3000-4000 tpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4
breng het supernatans over op verse emmers.
5
herhaal de vorige stappen.
6
filtreer het supernatans door een voorfilter (type AP; Millipore, Bedford, MA) om houtskool te verwijderen.
7
filtreer de oplossing door een 0.,45-μ m poriegrootte filter (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
bewaar aliquots bij -20°C.
gelatine (10 × voorraad)
1
Maak een 1% (g/v) gelatine-oplossing (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
autoclaaf gedurende 20 min.
3
Bewaren bij 4°C.
Gelatinecoate schalen / flessen
1
verdun de gelatinebouillon 10 keer.
2
Pipetteer deze oplossing op de schotels om het oppervlak van de schotel volledig te bedekken (1,5 tot 2 ml per schotel van 6 cm).
3
laat de gerechten gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Om deze procedure te versnellen kunnen ze 1 uur in de incubator bij 37°C worden geplaatst.,
4
zuig de schotels in.wikkel de schalen in aluminiumfolie en bewaar ze bij kamertemperatuur of bij 4°C.
HEBS-buffer (10× bouillon)
1 2
voeg dubbel gedestilleerd water toe aan 975 ml.
3
Pas de pH aan op 7,05 en het volume op 1000 ml.
4
autoclaaf de oplossing en bewaar deze bij 4°C.
5
vóór gebruik wordt gefilterde glucoseoplossing aan de buffer toegevoegd (zie bereiding van 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
verdun de hebs 10× bouillon vijfmaal met steriel H2O.
2
voeg 0,2 ml van een gefilterde glucoseoplossing (1 g / ml) per 100 ml (eindconcentratie 10 mM) toe.,
3
Pas de pH aan op 7,05-7,08. Deze stap is cruciaal voor de vorming van het Ca–DNA complex.
4
steriliseer de oplossing door filtratie.
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium (14200-067 m; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
medium
normaal medium: bereid met niet door warmte geïnactiveerd FCS en medium met fenolrood
steroïdedepletie medium: bereid met met houtskool gestripte FCS en medium zonder fenolrood. Dit medium wordt alleen gebruikt wanneer het effect van hormonen, normaal aanwezig in serum, moet worden getest.,
hoeveelheid plasmide gebruikt per transfectie
Reporter plasmide construct, 6,5 µg
Expressievector, 1,0 µg
Expressieplasmide als controle voor transfectie-efficiëntie, 0,5 µg
wanneer de totale hoeveelheid DNA minder dan 8 tot 10 µg is, moet dragerdna (plasmide-of haringsperma-DNA) worden toegevoegd om een goed CA-DNA-precipitaat
Lysisbuffer
te verkrijgen