Sistema bioluminescente geneticamente codificabile da funghi

• bioluminescenza
• luciferina fungina biosintesi
• luciferasi fungina

La bioluminescenza è un fenomeno naturale di emissione luminosa derivante dall’ossidazione di un substrato, la luciferina, catalizzata da un enzima, la luciferasi. Una varietà di specie sono bioluminescenti in natura (1); per molti di loro, la capacità di emettere luce è una caratteristica distintiva della loro biologia (2⇓-4). L’integrazione artificiale di reazioni bioluminescenti naturali nei sistemi viventi è diventata anche uno strumento di segnalazione ampiamente utilizzato nella biologia molecolare e cellulare (5, 6)., Tuttavia, i sistemi bioluminescenti naturali rimangono scarsamente caratterizzati a livello biochimico, limitando l’applicazione più diffusa. Solo 9 luciferine e 7 famiglie geniche luciferasi sono state descritte (7, 8) di almeno 40 sistemi bioluminescenti che si pensa esistano in natura (9). Purtroppo, solo una singola cascata biochimica che parte da un metabolita diffuso a una luciferina è stata descritta nella sua interezza (10). La via descritta è batterica e ha un’applicazione limitata negli eucarioti (11)., Nessuno dei sistemi bioluminescenti eucariotici è stato descritto in modo sufficientemente dettagliato per essere espresso in un altro organismo o per creare organismi bioluminescenti artificiali autonomamente. Qui, descriviamo la funzione e l’evoluzione dei geni chiave responsabili della bioluminescenza del fungo Neonothopanus nambi e mostriamo che l’espressione dei geni fungini è sufficiente per ingegnerizzare autonomamente gli eucarioti bioluminescenti.

Circa 100 specie fungine dell’ordine Agaricales emettono luce utilizzando la stessa reazione biochimica (12)., Anche se il ruolo ecologico della loro bioluminescenza non è completamente compreso, ci sono prove che potrebbe essere utilizzato dai funghi per attirare insetti spore-distribuzione (13). La bioluminescenza fungina era nota per utilizzare almeno quattro componenti: ossigeno molecolare ; la luciferina, che è stata recentemente identificata come 3-idrossiispidina; e due enzimi chiave precedentemente non descritti, un’idrossilasi H-dipendente NAD(P)e una luciferasi (15, 16).

Per identificare gli enzimi della via bioluminescente fungina, in primo luogo ci siamo concentrati sull’isolamento del gene luciferasi. Esprimendo la N., nambi cDNA library in Pichia pastoris e spruzzando piastre di agar con 3-idrossiispidina sintetica, abbiamo identificato e sequenziato una colonia di lievito luminescente che esprime il gene della luciferasi (Appendice SI, Fichi. S1 e S13). La N. nambi luciferasi, nnLuz, è una proteina 267-aa (Appendice SI, Fig. S2) e non ha omologhi descritti o similarità pronunciata di sequenza ai domini conservati della proteina, rappresentante una famiglia novella della proteina.

I geni che codificano per gli enzimi che sintetizzano i metaboliti secondari sono spesso raggruppati nei genomi fungini (17)., Abbiamo ipotizzato che questo possa essere il caso degli enzimi della cascata bioluminescente, perché si pensa che la cascata sia conservata tra i funghi bioluminescenti (12). Abbiamo quindi cercato geni legati alla biosintesi della luciferina nelle vicinanze del gene luciferasi nel genoma di N. nambi. Oltre a N. nambi, abbiamo anche sequenziato genomi e trascrittomi di funghi bioluminescenti Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor e Panellus stipticus e li abbiamo confrontati con sequenze genomiche disponibili pubblicamente di funghi bioluminescenti e nonbioluminescenti (18, 19)., Abbiamo scoperto che la luciferasi è un membro di un cluster genetico conservato, che include almeno altri due geni: h3h e hisps (Fig. 1 B e C e set di dati S1–S3).

Il gene h3h ha mostrato somiglianza di sequenza con 3-idrossibenzoato 6-monoossigenasi, enzimi che catalizzano l’ossidazione del 3-idrossibenzoato utilizzando NADH e ossigeno molecolare. Questa reazione è identica a quella che converte hispidin in luciferina (Fig. 1A); quindi, abbiamo ipotizzato che i codici del gene h3h per hispidin-3-idrossilasi (H3H), l’enzima corrispondente all’idrossilasi prevista (15)., Abbiamo clonato il gene da N. nambi e abbiamo scoperto che le colonie di P. pastoris che esprimono sia nnluz che nnh3h emettono luce quando spruzzate con luciferina precursore hispidin, a differenza delle colonie di controllo che esprimono nnluz da solo (Appendice SI, Fichi. S14 e S17)—confermando che nnH3H converte hispidin in luciferina.

Il gene hisps (Fig. 1C) codifica un membro della famiglia delle polichetidi sintasi, enzimi che producono metaboliti secondari in una varietà di organismi attraverso l’albero della vita (20)., Le polichetidi sintasi aggiungono tipicamente parti di malonile alla catena di carbonio in crescita; quindi, la natura α-pirone di hispidin ha suggerito che la sua biosintesi può essere eseguita da una polichetide sintasi dall’acido caffeico mediante due cicli di aggiunta di unità maloniliche seguiti da lattonizzazione (Fig. 1A e SI Appendice, Fig. S3). Le grandi sintetasi di polichetidi modulari richiedono modifiche post-traduttive per la loro attività (21), come il trasferimento di un gruppo fosfopanteteinile a un residuo di serina conservato del dominio delle proteine portatrici di acile., Per verificare se il gene hisps può produrre precursore di luciferina in un sistema eterologo, abbiamo integrato i geni hisps, nnluz e nnh3h insieme al gene NPGA della transferasi di Aspergillus nidulans 4′-fosfopantetheinil nel genoma di P. pastoris. Quando coltivati in un mezzo contenente acido caffeico, i lieviti che esprimevano tutti e quattro i geni emettevano luce vista ad occhio nudo (Fig. 3A), mentre non è stata osservata alcuna significativa produzione di luce in ceppi privi di geni npgA o hisps (Appendice SI, Figs. S15 e S17)., Pertanto, hisps catalizza la sintesi di hispidin dall’acido caffeico, chiudendo la catena di reazioni (il” ciclo dell’acido caffeico”) da un comune metabolita cellulare con nota biosintesi a una luciferina eucariotica.

In alcune specie di funghi bioluminescenti, il cluster genomico ospita uno o due geni aggiuntivi (Fig. 1C): uno appartenente alla famiglia del citocromo P450 e l’altro appartenente alla famiglia delle idrolasi fumarilacetoacetato., Quest’ultimo (cph) probabilmente codifica un’idrolasi caffeilpiruvato (Dataset S4) coinvolta nel riciclaggio dell’ossiluciferina, coerente con il caffeilpiruvato, l’ossiluciferina fungina, che viene idrolizzata a caffeato e piruvato da un’idrolasi presente negli estratti grezzi fungini (22).

La conservazione del cluster genetico suggerisce che, a differenza di altri gruppi di organismi bioluminescenti (23), la bioluminescenza si è evoluta nei funghi solo una volta, con i geni luz, h3h e hisps che emergono attraverso duplicazioni geniche. Alberi filogenetici ricostruiti per geni luz, h3h e hisps (Appendice SI, Fichi., S4-S6) e l’albero di specie dell’ordine Agaricales (Fig. 2) rivelare l’evoluzione della cascata di bioluminescenza nei funghi. L’enzima luz primario della cascata di bioluminescenza fungina è emerso attraverso una duplicazione genica alla base di Agaricales seguita dalla duplicazione di h3h e hisps pochi milioni di anni dopo. È interessante notare che molte specie in un grande clade che codifica hisps sono nonbioluminescenti, e gli omologhi hisps nelle specie bioluminescenti mancano di due domini, i domini ketoreduttasi e disidratasi (Appendice SI, Fig. S6)., È probabile che la perdita di questi domini funzionali nell’antenato comune delle specie bioluminescenti abbia favorito la produzione di α-pironi da parte di hisps ancestrali, fornendo forse il passo finale per l’emergere della bioluminescenza.

Il cluster genetico ha continuato ad evolversi dinamicamente dopo l’acquisizione della bioluminescenza. Almeno sei eventi indipendenti di perdita genica completa o parziale dei geni del cluster genomico hanno portato alla perdita secondaria di bioluminescenza (Fig. 2). Il gene cph è stato inserito nel cluster nel clade nonmycenoid, forse due volte (Fig. 1)., Questo schema a mosaico assomiglia alla storia evolutiva delle proteine fluorescenti (24), un’altra famiglia di proteine visivamente rilevante con un ruolo biologico poco chiaro, e può indicare che il vantaggio selettivo fornito dalla bioluminescenza nei funghi dipende da un contesto ecologico specifico o transitorio.

Gli adattamenti complessi possono essere una fonte di soluzioni biotecnologicamente rilevanti., Oltre a rivelare la natura dei processi fotochimici di base e dell’evoluzione delle proteine, le luciferasi sono tra i principali tipi di geni reporter utilizzati in varie pipeline di ricerca, metodi di diagnostica e applicazioni ambientali (5, 6, 25). Per determinare se un percorso bioluminescente fungino può fornire geni reporter, abbiamo caratterizzato nnLuz in vitro e testato la sua capacità di produrre luce nei sistemi eterologhi.

La proteina nnLuz è costituita da 267 aminoacidi e ha una massa molecolare di circa 28,5 kDa (Appendice SI, Fig. S7)., Sebbene la sua localizzazione cellulare in vivo rimanga sconosciuta, la proteina ha un’elica transmembrana N-terminale prevista, coerente con la colocalizzazione dell’attività della luciferasi con frazioni cellulari insolubili in studi precedenti (22). Quando espresso in P. pastoris, nnLuz è stato associato alla frazione microsomiale (Appendice SI, Fig. S8) e ha emesso luce verde con un massimo a 520 nm e spettro identico a quello del micelio N. nambi (Fig. 3A e SI Appendice, Fig. S9). nnLuz ricombinante emette luce in modo ottimale a circa pH 8.,0 e temperature moderate, perdendo la sua attività a temperature superiori a 30 °C (SI Appendice, Fig. S10).

Per testare il potenziale di nnluz come gene reporter nei sistemi eterologi, abbiamo testato la sua espressione in Escherichia coli, P. pastoris, embrioni di Xenopus laevis precoci e cellule umane., Sebbene la luciferasi si accumulasse principalmente nei corpi di inclusione quando espressa nei batteri (Appendice SI, Fig. S7), tutte le cellule e gli organismi testati che esprimono nnluz wild-type erano chiaramente bioluminescenti quando 3-idrossiispidina è stata aggiunta al mezzo (Fig. 3 e SI Appendice, Fichi. S11 e S22). Abbiamo anche confrontato qualitativamente nnLuz con la luciferasi della lucciola Photinus pyralis in una configurazione di imaging di tutto il corpo di xenotrapianti tumorali nei topi. Noi s. c., impiantato uguali quantità di cellule di carcinoma del colon murino che esprimono nnluz o lucciola luciferasi sotto lo stesso promotore, iniettato una miscela di lucciola e luciferine fungine i. p., e ottenuto segnali quasi identici dagli impianti (Fig. 3 QUATER).

Infine, abbiamo cercato di verificare se la biosintesi della luciferina può essere raggiunta in organismi privi di biosintesi dell’acido caffeico. Introduzione di tre geni aggiuntivi che codificano per gli enzimi della biosintesi dell’acido caffeico da tirosina, Rhodobacter capsulatus tirosina ammoniaca liasi e due E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase componenti (26), nel genoma di P. pastoris ceppo portando NPGA, hisps, h3h, e geni luz portato in un ceppo che è stato autonomamente bioluminescente quando coltivato in un mezzo di lievito standard (SI Appendice, Fichi. S12 e S16).

Pertanto, in tutte le condizioni testate, la luciferasi N. nambi wild-type è funzionale nei sistemi eterologi, posizionandosi come un promettente gene reporter e la luciferina fungina può essere sintetizzata da amminoacidi aromatici in altri eucarioti., Inoltre, la luciferina fungina è un composto idrosolubile e permeabile alle cellule e la sua reazione emettitrice di luce non dipende dalla disponibilità di ATP, rendendo il sistema bioluminescente fungino attraente per numerose applicazioni nell’imaging biomedico. Inoltre, vari analoghi della luciferina possono essere utilizzati per migliorare l’emissione luminosa e sintonizzare i suoi spettri, migliorando la penetrazione della luce nelle applicazioni di imaging dei tessuti profondi (22).

In conclusione, presentiamo la cascata enzimatica che porta all’emissione di luce nei funghi, che è un sistema di bioluminescenza eucariotica con nota biosintesi di luciferina., Abbiamo dimostrato che luciferina è sintetizzato dal suo precursore hispidin da N. nambi H3H e che hispidin può essere sintetizzato direttamente da hispidin sintasi da acido caffeico, un metabolita cellulare diffuso con biosintesi efficiente che è stato raggiunto in vari organismi, compresi i ceppi di lievito industrialmente rilevanti (26)., A soli due passi enzimatici dalle vie metaboliche tradizionali, il sistema fungino ha un alto potenziale per la biologia sintetica di creare autonomamente animali e piante incandescenti: i tentativi di sviluppare tali organismi sono stati finora limitati dalle scarse prestazioni negli eucarioti del sistema bioluminescente batterico, l’unico sistema per il quale era nota la biosintesi della luciferina (27, 28).

La ricostituzione della via bioluminescente fungina in organismi eucariotici potrebbe consentire applicazioni in cui tessuti o organismi riportano cambiamenti nel loro stato fisiologico con emissione di luce autonoma., Potrebbe anche spingere in avanti lo sviluppo della prossima generazione di architettura organica (29), in cui le piante incandescenti geneticamente modificate saranno integrate negli edifici e nelle infrastrutture cittadine. Oltre a questo, con la sua storia evolutiva intrigante, una famiglia di luciferasi, e la semplicità complessiva, il sistema bioluminescente fungina qui presentato è un parco giochi molecolare in possesso di numerose opportunità per la ricerca di base e applicata.,