Siero di vitello fetale carbone-stripped (vedi anche rif. 3)
1
Aggiungere 250 mg di carbone e 25 mg di destrano T – 70 a 100 ml di siero di vitello fetale (FCS).
2
Incubare a 56°C per 30 min.
3
Centrifugare a 3000-4000 giri / min per 30 min a temperatura ambiente.
4
Trasferire il surnatante in secchi freschi.
5
Ripetere i passaggi precedenti.
6
Filtrare il surnatante attraverso un prefiltro (tipo AP; Millipore, Bedford, MA)per rimuovere il carbone.
7
Filtrare la soluzione attraverso uno 0.,45-μ m pore size filter (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
Conservare le aliquote a -20°C.
Gelatina (10 × Stock)
1
Fare una soluzione all ‘ 1% (p/v) di gelatina (G-2500; Sigma, St. Louis, MO)
2
Autoclave per 20 min.
3
Conservare a 4°C.
Piatti/flaconi rivestiti di gelatina
1
Diluire il brodo di gelatina 10 volte.
2
Pipettare questa soluzione sui piatti per coprire completamente la superficie del piatto (da 1,5 a 2 ml per piatto da 6 cm).
3
Lasciare i piatti per 2 ore a temperatura ambiente. Per accelerare questa procedura possono essere collocati nell’incubatore a 37°C per 1 ora.,
4
Aspirare i piatti.
5
Avvolgere i piatti in un foglio di alluminio e conservarli a temperatura ambiente o a 4°C.
Buffer HEBS (10× stock)
1 2
Aggiungere acqua doppia distillata a 975 ml.
3
Regolare il pH a 7,05 e il volume a 1000 ml.
4
Autoclavare la soluzione e conservarla a 4°C.
5
Prima dell’uso, la soluzione di glucosio filtrata viene aggiunta al tampone (vedere preparazione di 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
Diluire il brodo di HEBS 10× cinque volte con H2O sterile.
2
Aggiungere 0,2 ml di una soluzione di glucosio filtrata (1 g/ml) per 100 ml (concentrazione finale, 10 mm).,
3
Regolare il pH a 7,05-7,08. Questo passaggio è cruciale per la formazione del complesso Ca–DNA.
4
Sterilizzare la soluzione per filtrazione.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
Terreno normale: preparato con FCS non inattivato a caldo e mezzo con rosso fenolo
Terreno impoverito con steroidi: preparato con FCS a carbone e mezzo senza rosso fenolo. Questo mezzo viene utilizzato solo quando l’effetto degli ormoni, normalmente presenti nel siero, deve essere testato.,
Quantità di plasmide utilizzata per trasfezione
Reporter plasmid construct, 6.5 µg
Vettore di espressione, 1.0 µg
Espressione plasmide come controllo per l’efficienza della trasfezione, 0.5 µg
Quando la quantità totale di DNA è inferiore a 8 a 10 µg, DNA vettore (plasmide o DNA di sperma di aringa) deve essere aggiunto al fine p> Tampone di lisi