1 Introduzione
Le proteine di membrana integrali costituiscono una grande percentuale dei genomi di molti organismi—circa il 25% del genoma umano—e svolgono una vasta gamma di funzioni, comprese le fasi chiave nella comunicazione di una cellula con il suo ambiente., A causa della loro importanza biologica e terapeutica (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), le proteine di membrana sono al centro della ricerca biofisica fondamentale e applicata per caratterizzare strutture tridimensionali, dinamiche e interazioni in ambienti nativi.,
La spettroscopia NMR a stato di soluzione ha svolto un ruolo critico negli studi biofisici sulle proteine di membrana, poiché le informazioni dinamiche e di interazione site-specific fornite da tali approcci integrano piacevolmente i dati strutturali ottenuti da diffrazione a raggi X, crioem e analisi computazionali (Cuniasse, Tavares, Orlova,& Zinn-Justin, 2017;> Marassi, 2017)., Fondamentali per tali studi sono diversi “spettri di impronte digitali” 2D, più spesso 15N / 1H HSQC (heteronuclear single-quantum coherence) spettri (per backbone amide plus Trp, Asn e Gln sidechain) o metil 13C / 1H HMQC (heteronuclear multiple-quantum coherence) spettri per gruppi metilici sidechain (Pellecchia et al., 2008). Questi esperimenti metil-diretti sono particolarmente vantaggiosi per grandi complessi lipidici / proteici a membrana lenta; sono stati applicati con successo anche esperimenti diretti ad altri siti sidechain e mainchain., Esperimenti NMR in grado di fornire informazioni sulla dinamica di proteine su molti tempi, dal fast (ps–ns) sidechain movimenti lenti cambiamenti conformazionali (ms–ms) (Kasinath, Sharp, & Bacchetta, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012, Bacchetta, Moorman, & Harpole, 2013)., Molte di queste dinamiche esperimenti, usando spesso il sidechain gruppi metilici come sonde, sono stati adattati e sviluppati per i grandi sistemi biomolecolari e può essere utilizzato per le proteine di membrana (Rosenzweig & Kay, 2014; Sole, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
Un particolare vantaggio della NMR a stato di soluzione è che le proteine sono studiate in uno stato di soluzione simile a quello nativo in cui possono interconvertirsi tra più conformazioni., Tuttavia, le proteine di membrana devono essere solubilizzate in una membrana mimetica adatta che mantenga la struttura e la dinamica native. Diverse opzioni includono micelle detergenti, anfipoli, bicelle, nanodischi, SMALPs e vescicole lipidiche, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Spesso è necessario testare diverse strategie di solubilizzazione per un determinato campione di proteine per stabilità, intensità e risoluzione del segnale e struttura/attività nativa., Due considerazioni importanti per tutti i mimetici a membrana sono (1) una dimensione uniforme e piccola delle particelle e (2) un’elevata estensione di deuterazione.
La deuterazione ad alto livello, sia all’interno della membrana mimetica che della proteina stessa, è fondamentale per ridurre il numero di segnali 1H presenti negli spettri (compresi quelli dei lipidi, che possono essere intensi) e per migliorare le caratteristiche di rilassamento dei restanti spin NMR-attivi nel campione., Mentre la deuterazione è possibile per la membrana mimetica attraverso l’acquisto / sintesi di composti deuterati, la sostituzione di 1H con 2H nelle proteine richiede l’incorporazione biosintetica. Per gli esperimenti di backbone nei sistemi di espressione eucariotica, si può etichettare uniformemente con 15N per osservare tutte le ammidi (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai,& Grzesiek, 2015) o attraverso l’aggiunta di aminoacidi specificamente etichettati (Isogai et al., 2016)., Per i gruppi metilici, si possono fornire aminoacidi opportunamente etichettati o precursori di aminoacidi (in particolare alfa-chetoacidi) ai supporti di crescita per accedere a vari modelli di etichettatura nelle catene laterali di diversi amminoacidi (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucina δ1 gruppi metilici particolarmente utile dato (1) l’abbondanza di Ile di residui di proteine integrali di membrana tra Gpcr (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) l’estremo bambola 13C spostamento di isoleucina δ1 gruppi metilici , metterli in una particolarmente affollate regione 2D 13C/1H spettri, (3) la mancanza di necessità di stereospecifically assegnare questi gruppi metilici, a differenza di Val e Leu, e (4) la presenza di più, ruotabile di legami tra il gruppo metilico e proteine spina dorsale, fornendo un sostanziale indipendenza delle dinamiche di questi siti (Kasinath et al.,, 2013).
Mentre molte delle strategie di etichettatura di cui sopra sono state ben sviluppate per E. coli, molte proteine di membrana integrali possono essere espresse solo ad alti livelli negli ospiti eucariotici. Tra questi, il lievito metilotrofico Pichia pastoris è un ospite conveniente per l’espressione eterologa e l’etichettatura isotopica delle proteine di membrana eucariotiche (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Vantaggi di Pichia includono rapidità di manipolazione genetica, rese elevate di proteina ricombinante, l’esistenza di modificazioni post-traduzionali (PTM) e chaperone macchinari necessari per eucariotica proteine di membrana, e la capacità di crescere sul minimo definito mezzi che consentono di perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). L’etichettatura isotopica uniforme in Pichia è stata ben consolidata (Morgan et al., 2000; Pickford& O’Leary, 2004)., Abbiamo esteso questo lavoro dimostrando l’etichettatura 13C, 1H dei gruppi di isoleucina δ1-metile in uno sfondo perdeuterato aggiungendo α-ketobutirrato etichettato (~50% etichettatura, ~ 90% deuterazione) a mezzi di crescita altamente deuterati (Clark et al., 2017, 2015). Al contrario, l’etichettatura simultanea dei gruppi γ – metil di leucina δ e valina con α-chetoisovalerato è inefficiente ma può essere ottenuta aggiungendo valina etichettata direttamente ai terreni di crescita o modificando le condizioni di coltura (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia può facilmente assumere aminoacidi aggiuntivi dai media, con una correlazione generale tra l’efficienza di assorbimento e il costo energetico per sintetizzare quel tipo di aminoacido de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Tuttavia, dopo l’assorbimento nelle cellule, gli amminoacidi marcati possono essere alimentati in vie metaboliche (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), diluendo il segnale degli amminoacidi desiderati e complicando l’analisi dei dati mediante rimescolamento isotopico., In alternativa, i ceppi auxotrofi possono essere sviluppati per etichettare uno specifico amminoacido; tuttavia, bisogna fare attenzione a confermare che non si verificano effetti fuori bersaglio in altre vie metaboliche (Whittaker, 2007).
Qui forniamo protocolli dettagliati necessari per generare tali proteine di membrana integrali marcate con U-2H (13C, 1H -le δ1 metile) mediante sovraespressione in Pichia, utilizzando il recettore umano dell’adenosina A2A come sistema modello., Abbiamo ulteriormente dettagliato come tali campioni possono essere utilizzati in studi di soluzione NMR, dall’acquisizione di semplici spettri HMQC 13C/1H, attraverso assegnazioni di shift chimici per mutagenesi diretta al sito, alle analisi di misurazioni di rilassamento incrociato 1H-1H di dinamiche sidechain veloci.