TESTO
Il clostridium difficile è un patogeno nosocomiale anaerobico sporigeno associato a diarrea o colite da lieve a pericolosa per la vita (1, 2). La colonizzazione di C. difficile aumenta con la durata della degenza ospedaliera in seguito all’esposizione ambientale alle spore o al contatto con una persona infetta (3). La contaminazione e la sopravvivenza delle spore di C. difficile su superfici inanimate ospedaliere sono state riportate (4, 5) e hanno dimostrato di essere associate a trasmissione incrociata (6,-8).,
L’inattivazione e l’eradicazione delle spore di clostridium difficile sono una sfida e sono state studiate diverse tecniche relativamente nuove, come il vapore di perossido di idrogeno, le radiazioni UV o i sistemi di plasma gassoso(5, 6, 9, 10). La convalida di tali tecniche dovrebbe utilizzare metodi di recupero ottimali per quantificare meglio l’uccisione o l’eradicazione delle spore batteriche.
Una varietà di metodi sono stati utilizzati per rilevare C. difficile dall’ambiente ospedaliero con risultati variabili (11, 12). Qui riportiamo una valutazione di diversi metodi per rilevare e recuperare C., spore difficili da materiali che si trovano comunemente nell’ambiente ospedaliero.
(I dati preliminari derivanti da questo studio sono stati presentati come poster al Congresso europeo di Microbiologia clinica e malattie infettive, Barcellona, Spagna, maggio 2014.)
Nello studio sono stati inclusi un ceppo di riferimento C. difficile, ATCC 700057 (Cruinn Diagnostics, Irlanda) e un isolato clinico non caratteristico (Diagnostic Laboratory, Beaumont Hospital, Dublino, Irlanda). Una modifica del protocollo di preparazione delle spore C. difficile descritto da Chilton et al. è stato utilizzato (13). In breve, C., difficile è stato inoculato in un’infusione di cuore cerebrale preridotta integrata con estratto di lievito e l-cisteina, incubata anaerobicamente a 37°C per 48 h e distribuita su 10 piastre di agar del sangue Columbia (Oxoid, Regno Unito), che sono state incubate anaerobicamente a 37°C per 10 giorni (14). La crescita è stata raccolta dalle piastre utilizzando un raschiatore cellulare e sospesa in 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-etanolo (50% ). Le sospensioni sono state incubate a temperatura ambiente per 1 h con miscelazione periodica., Le sospensioni di spore sono state centrifugate per 10 min a 16.000 × g e i pellet sono stati risospesi in 1 ml di PBS. I numeri di spore e la purezza sono stati determinati al microscopio utilizzando il kit Schaeffer e Fulton spore stain (Sigma-Aldrich, Irlanda). Le sospensioni sono state regolate a una concentrazione di circa 105 CFU / ml (una colonia è equivalente a una spora) e le diluizioni seriali 1:10 sono state preparate in PBS.
C., le sospensioni di spore difficili (50 µl), che vanno da 105 a 10 CFU/ml, sono state aggiunte in duplicato a sezioni da 25 cm2 di tessuto per materassi in poliuretano (Meditec Medical, Irlanda), polipropilene (GoodFellow Cambridge, Ltd., Regno Unito) e acciaio inossidabile, tutti decontaminati come descritto in precedenza (15). Le sospensioni di spore applicate alle superfici sono state asciugate all’aria su 2 h. Le superfici sono state campionate utilizzando tamponi di rayon premoistened e tamponi in nylon floccato (Copan, Italia) e poste in 3 ml PBS. Le diluizioni seriali delle sospensioni a tampone sono state inoculate su piastre selettive C. difficile prepoured-C., difficile agar base CM0601 plus C. difficile supplemento SR0096 (250 mg/litro d-cicloserina, 8 mg / litro cefoxitina) e 7% (vol/vol) defibrinato sangue di cavallo (SR0050)—fornito da Oxoid per l’enumerazione di CFU/ml. Le piastre di contatto sterili (VWR) sono state versate in laboratorio con agar selettivo C. difficile e applicate a ciascuna sezione per 20 s, garantendo un contatto costante con la superficie. Le piastre sottoculturate di entrambi i tamponi e le piastre di contatto sono state incubate durante la notte anaerobicamente a 37°C. L’enumerazione delle colonie è stata eseguita il giorno successivo., Il limite di rilevazione (LOD) è stato definito come la più bassa concentrazione di spore applicata che è stata rilevata da un metodo specifico. Tutti i metodi sono stati valutati in modo indipendente per l’intera sezione e sono state confrontate le loro capacità di rilevare e recuperare le spore di C. difficile. L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism 5.00. I mezzi di tre esperimenti indipendenti della percentuale di recupero per i diversi metodi sono stati analizzati mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e test di confronto multiplo di Tukey.,
Nel 1983 una delle prime relazioni che confrontavano i metodi per il recupero di spore di C. difficile da una superficie di vetro ambientale ha mostrato che di tamponi, pagaie adesive e piastre di contatto, le piastre di contatto erano di gran lunga il metodo più efficiente, rilevando spore a livelli bassi, essendo più semplici da usare e relativamente rapidi (16). Da allora, vari metodi, inclusi tamponi, piastre di contatto, guanti e spugne, sono stati utilizzati per ricerche e indagini su focolai con risultati variabili. Qui, dimostriamo che le piastre di contatto hanno raggiunto il più alto recupero di C., spore difficili (dal 14% al 92%) da varie superfici, tra cui il materiale del materasso, polipropilene e acciaio inossidabile, confermando ed estendendo i risultati di Buggy et al. (16) per il recupero dal vetro. Il recupero è stato efficace anche per i tamponi floccati (dal 14% al 76%) e il metodo meno efficiente è stato il tampone rayon (dal 7% al 58%) (Fig. 1A e B).B). La percentuale di recupero era direttamente proporzionale alla dimensione dell’inoculo iniziale—cioè, un inoculo di 105 CFU/ml ha permesso alle piastre di contatto di recuperare fino al 92% e fino al 14% per un inoculo da 10 CFU/ml., Le piastre di contatto erano anche più sensibili nel rilevare le spore con un inoculo minimo di 10 CFU / ml, mentre il LOD era 102 CFU/ml per i tamponi floccati e 103 CFU/ml per i tamponi di rayon, ma questo era vero solo per l’isolato clinico. Statisticamente, le piastre di contatto erano migliori dei tamponi floccati su polipropilene per l’isolato clinico (P < 0,05) (Tabella 1) e persistentemente superiori ai tamponi in rayon (P < 0,05 a P < 0,001) (Tabella 1), mentre non c’era differenza significativa fra floccato e tamponi di rayon., Sebbene l’analisi statistica non abbia rivelato alcuna differenza significativa nei recuperi tra tutte le superfici studiate, i recuperi dal materiale del materasso sono stati leggermente ridotti rispetto a quelli delle altre due superfici. Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza statistica tra i due isolati.
Percentuale di recupero delle spore di Clostridium difficile del ceppo di riferimento (A) e dell’isolato clinico (B) da tre superfici ambientali mediante piastre di contatto, tamponi floccati e tamponi di rayon., Le barre di errore rappresentano gli errori standard dei mezzi (SEM) di almeno tre esperimenti indipendenti (n ≥ 3).,”1″> valore di P di analisi statistica ofa:
C., le spore difficili possono essere versate nell’ambiente da pazienti sia asintomatici che sintomatici e possono sopravvivere fino a 5 mesi su superfici inanimate (17). Resistono agli effetti battericidi della maggior parte dei disinfettanti ospedalieri e della maggior parte delle altre tecniche di decontaminazione (18). Pertanto, gli interventi dovrebbero essere monitorati in locali attualmente o precedentemente occupati da portatori di C. difficile. La segnalazione di metodi migliorati in termini di velocità e sensibilità, come la piastra di contatto e i tamponi floccati riportati qui, fornisce una stima più accurata del C., carico difficile rispetto ai metodi precedentemente riportati. Dato che C. difficile è l’endospore più importante nell’ambito sanitario di oggi e presenta un rischio di infezione significativo per i pazienti vulnerabili, vi è una crescente necessità di quantificare con precisione la contaminazione da spore di C. difficile nell’ambiente sanitario. Questo sarebbe allo scopo di valutare nuovi metodi di decontaminazione e correlare i livelli di contaminazione ambientale con il rischio di infezione e il verificarsi di focolai., Tuttavia, migliorare i metodi di recupero accettati utilizzando materiali che rappresentano quelli trovati nell’ambiente ospedaliero sono un prerequisito necessario.