… basato su BactoScan FC, che utilizza il bromuro di etidio per macchiare i batteri nel latte, fornisce un risultato dopo 8 min (5, 30). In precedenza è stata descritta anche una tecnica citometrica a flusso per misurare la TBC nel latte crudo e ad altissima temperatura con la macchia SYTO BC (16). Tuttavia, queste tecniche sono molto specifiche, rilevando una sola specie, o non specifiche, rilevando tutti i batteri., Le tecniche citometriche di flusso per la differenziazione dei batteri nel latte in gruppi più grandi come i batteri gram-positivi e gram-negativi non sono ancora state descritte. La colorazione di Gram fu inizialmente descritta nel 1883 dal collega di Christian Gram Carl Friedlander, dividendo i batteri in due gruppi, e di nuovo nel 1884 da Christian Gram (12, 14). La procedura di colorazione Gram convenzionale include le macchie crystal violet e safranin. Le celle termofissate su un vetrino sono macchiate di blu-viola con viola cristallino e, successivamente, vengono trattate con etanolo., I batteri gram-negativi vengono decolorati dall’etanolo, mentre i batteri gram-positivi rimangono macchiati di viola cristallino. In seguito, safranin è usato per contrastare i batteri gram-negativi, dando a questo gruppo un aspetto rosa. Sono stati riportati numerosi approcci alternativi per identificare la reazione di Gram. Un metodo in cui una colonia di batteri è sottoposta al 3% di idrossido di potassio è ampiamente utilizzato. L’alta concentrazione di idrossido di potassio lisizza i batteri gram-negativi, rilasciando il DNA dalle cellule, che può essere confermato tirando una stringa viscosa dalla colonia (15, 26)., È stata descritta una tecnica alternativa di colorazione Gram con una lectina coniugata con fluoresceina germe di grano agglutinina (WGA) per epifluorescenza combinata e un microscopio a contrasto di fase (29). La WGA si lega alla N-acetilglucosamina nello strato di pep-tidoglicano della parete cellulare. I batteri gram-negativi hanno uno strato di lipopolisaccaride che copre la parete cellulare ed è per questo che non sono macchiati con WGA, mentre i batteri gram-positivi sono macchiati con WGA, in quanto non hanno uno strato di lipopolisaccaride., Questi risultati hanno mostrato un’insensibilità all’età della coltura che implicava che questa macchia poteva essere utilizzata direttamente sui campioni senza precultivazione del campione. È stata descritta una versione modified della tecnica WGA per i batteri trovati in un ambiente non alimentare in cui i batteri sono immobilizzati su un ltro, lavati e poi colorati con WGA (11). Sono state proposte anche alcune tecniche di colorazione Gram per la citometria a flusso continuo. Uno utilizza la macchia lipofila fl uorescente rho-damine 123, che macchia selettivamente i batteri gram-positivi., Lo strato lipopolisaccaridico di batteri gram-negativi pre-sfoga l’ingresso di rodamina 123 (1, 28). Un’altra tecnica simile combina le due macchie di legame del DNA fluorescente, SYTO 13 e ioduro di esidio (HI). SYTO 13 è una macchia permeabile alla membrana e HI è bloccato dallo strato lipopolisaccaridico di batteri gram-negativi e quindi permeabile solo ai batteri gram-positivi e ai batteri gram-negativi con uno strato lipopolisaccaridico de – stabilizzato (22). Tuttavia, a causa della natura fragile dello strato di lipopolisaccaridi, queste tecniche non sono ritenute adatte per campioni incolti., Lo scopo del presente lavoro è stato quello di sviluppare una tecnica di colorazione Gram basata sulla colorazione di batteri con WGA e HI e seguita da rilevazione citometrica fl ow. La tecnica è stata valutata su batteri associati al latte (19, 20) nella fase stazionaria e dopo 6, 12 e 48 ore di incubazione in ambienti labo – ratori. Inoltre, il metodo è stato testato su colture in fase stazionaria che erano state conservate per 24 ore a Ϫ 18 ° C e per 14 giorni a 5 ° C. Infine, la tecnica è stata applicata al latte di serbatoio sfuso a spillo con batteri noti., Una tecnica per la differenziazione dei batteri gram-positivi e gram-negativi nel latte del carro armato alla rinfusa senza precultivazione sarà l’ultima applicazione. La figura 1 mostra l’effetto della concentrazione di KCl sul legame di WGA con i batteri gram-positivi M. luteus e S. uberis , quando i batteri sono macchiati dal solo WGA, escluso HI. Negli istogrammi il rumore è visto a sinistra, dove si sono accumulati eventi con bassa intensità di fluorescenza (un trebbio è stato usato per tagliare via la maggior parte del rumore)., Quando i batteri sono macchiati suf fi cientemente per distinguerli dal rumore, appariranno come un picco completamente separato dal rumore. Usando 0 M KCl, nessuno dei due batteri è stato macchiato abbastanza da separarli dal rumore. Utilizzando 1 M KCl, è stata osservata una maggiore intensità di fluorescenza per entrambi i batteri. M. luteus è stato poi separato dal rumore, e S. uberis solo leggermente over – lappato il rumore. L’aumento della concentrazione di KCl a 3 M ha ulteriormente migliorato il legame (intensità di fluorescenza più elevate) di WGA a questi ceppi batterici, specialmente per M. luteus ., Osservazioni microscopiche hanno dimostrato che i batteri gram-positivi sono stati macchiati da WGA, mentre i batteri gram-negativi non sono stati macchiati da WGA. HI macchiato sia i batteri gram-positivi e gram-negativi. La figura 2 mostra un esempio della colorazione di una miscela (1:1) del M. luteus gram-positivo e dell’E. coli gram-negativo con WGA e HI. Come risultato della colorazione, M. luteus è apparso con una superficie verde (WGA) e un citoplasma rosso (HI), mentre E. coli è apparso solo con un citoplasma rosso. Diagrammi isometrici di analisi citometriche fl ow di colture di E. coli, M., luteo, e una miscela (1:1) di questi sono mostrati in Fig. 3. Misurazione di E. coli da solo (Fig. 3A), il 100% degli eventi era presente nella regione gram-negativa. Solo per M. luteus (Fig. 3B), il 99% degli eventi era nella regione gram-positiva e l ‘ 1% degli eventi entrava nella regione gram-negativa. Quando le colture di E. coli e M. luteus sono state mescolate (Fig. 3C), il 50% degli eventi è stato osservato in ciascuna regione. Ciascuno dei ceppi batterici 12 è stato misurato in duplice copia dopo 6,12, 24 e 48 h di incubazione. Da ogni misurazione, sono stati utilizzati 100 eventi per i calcoli. In Fig., 4 viene presentata una trama assemblata che include tutti gli eventi 800 per ciascuno dei ceppi batterici 12 testati durante 48 h di incubazione (un totale di eventi 9,600). Ogni ceppo batterico è presentato con un colore distinto. Viene mostrata una linea migliore calcolata per separare i batteri gram-positivi e gram-negativi. Nel complesso, la linea ha assicurato il 97% degli eventi da interpretare correttamente. Le percentuali di cellule correttamente interpretate per i singoli ceppi sono state calcolate e sono presentate nella Tabella 1. Per E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus, S. aureus, S. agalactiae, S., dys-galactiae e S. uberis , quasi tutte le cellule (9 96%) sono state correttamente interpretate per qualsiasi tempo di incubazione. Per B. cereus, P. fl uores-cens e P. putida , il 93% delle cellule è stato interpretato correttamente dopo 12 e 24 ore di incubazione, mentre dopo 6 e 48 ore di incubazione solo il 75-89% delle cellule è stato interpretato correttamente. Nella tabella 2 sono presentati i risultati delle analisi citometriche delle colture sottoposte a diverse condizioni di conservazione., Quando le colture sono state conservate a 5 ° C per 14 giorni, la tecnica di colorazione sembrava essere influenzata dall’età della coltura, specialmente per i batteri gram-negativi. La percentuale media di celle correttamente interpretate era dell ‘ 86%. Per E. coli, M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae e S. uberis , la maggior parte delle cellule ( 9 97%) sono state interpretate correttamente. Per B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis e S. aureus , il 76-89% sono stati correttamente interpretati, e per P. fl uorescens e P. putida , le cifre erano rispettivamente del 58 e del 68%., Il congelamento non sembrava ininfluire sulla tecnica di colorazione. Dopo la conservazione a Ϫ 18 ° C per 24 ore, 9 98% delle cellule sono state interpretate correttamente per E. cloacae, E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae e S. uberis . Per B. cereus e P. fl uorescens, le percentuali erano rispettivamente dell ’83 e dell’ 82%. La figura 5 mostra i diagrammi isometrici degli anali fl ow-citometrici di S. aureus ed E. coli aggiunti al latte di serbatoio sfuso. Per S. aureus (Fig. 5A), il 98% degli eventi era nella regione gram-positiva e il 2% degli eventi entrava nella regione gram-negativa., Per E. coli (Fig. 5B), il 96% degli eventi si è verificato nella regione gram – negativa e il 4% degli eventi è entrato nella regione gram-posi – tiva. Il contributo dei batteri naturali presenti nel latte ha rappresentato meno dello 0,1%. L’aggiunta di un’alta concentrazione di KCl alla soluzione di colorazione ha migliorato la capacità di WGA di macchiare i batteri gram-positivi. Una possibile spiegazione è che i batteri gram-positivi hanno acidi teichoici attaccati perpendicolarmente alle loro pareti cellulari, che, per alcuni batteri gram-positivi, possono bloccare l’accesso di WGA alla parete cellulare., Quando la concentrazione di KCl è bassa, la struttura degli acidi teichoici è rigida, ma aumentando la concentrazione di KCl, la struttura sarà allentata mentre gli ioni di potassio eliminano le cariche negative sugli acidi teichoici, causando il collasso della struttura (8, 9). La composizione e la struttura degli acidi teichoici variano tra le spezie gram-positive (24), il che può spiegare perché un aumento della concentrazione di KCl da 1 a 3 M ha avuto un effetto maggiore su M. luteus rispetto a S. uberis . Nel presente lavoro, 3 M KCl è stato utilizzato per massimizzare il legame di WGA ai batteri gram-positivi., Le tecniche per l’eliminazione dell’organizzazione degli acidi teichoici sono state precedentemente riportate solo per applicazioni microscopiche. Queste tecniche includono l’uso di tetrossido di osmio mediante aggiunta ed evaporazione di acetone (2) e di calore di batteri su un vetrino microscopico (29). Tuttavia, questi trattamenti non hanno potuto essere considerati nel presente studio, poiché una fase di disidratazione non è adatta per la citometria a flusso continuo., La tecnica di colorazione Gram ha mostrato risultati affidabili per tutti i ceppi dopo 6, 12, 24 e 48 h di incubazione, per i quali quasi tutte le cellule (97%) sono state correttamente interpretate. Questi risultati sono conformi ai risultati del metodo di colorazione con gram WGA …