1 Bevezetés
Szerves membrán fehérjék teszik ki a nagy részét a genom szekvenciát jelent, sok szervezetek—mintegy 25% – a a humán genom—, majd hajtsa végre a legkülönbözőbb funkciókat, beleértve a kulcsfontosságú lépéseket a kommunikáció a sejt környezetével., Biológiai és terápiás jelentőségük (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009) miatt a membránfehérjék az alapvető és alkalmazott biofizikai kutatások középpontjában állnak a háromdimenziós struktúrák, dinamikák és kölcsönhatások jellemzésére natív környezetben.,
Megoldás-állami NMR spektroszkópia játszott döntő szerepet a membrán fehérje biofizikai vizsgálatok, mint a hely-specifikus dinamikus kölcsönhatás által szolgáltatott információk ilyen megközelítések szépen kiegészíti a strukturális kapott adatok röntgendiffrakciós, krio-EM, számítógépes elemzések (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Alapvető az ilyen vizsgálatok több 2D “ujjlenyomat spektrumok,” leggyakrabban 15N/1h hsqc (heteronukleáris egy kvantum koherencia) spektrumok (a gerinchálózat amid plusz Trp, Asn, és Gln sidechains) vagy metil 13C/1H HMQC (heteronukleáris több kvantum koherencia) spektrumok sidechain metilcsoportok (Pellecchia et al., 2008). Ezek a metil-irányított kísérletek különösen előnyös a nagy, lassan bukdácsoló membrán fehérje/lipid komplexek; kísérletek irányított más oldallánc, valamint mainchain oldalak sikeresen alkalmazták is., NMR kísérletek információt nyújt arról, fehérje dynamics több időkeretet, a gyors (ps–ns) oldallánc mozgások lassú conformational változások (µs–ms) (Kasinath, Éles, & Pálca, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Pálca, Moorman, & Harpole, 2013)., Sok ilyen dynamics kísérletek, gyakran használja a oldallánc metil-csoportok, mint szonda, a kiigazított alakult ki a nagy biomolecular rendszereket lehet használni a membrán fehérjék (Rosenzweig & Kay, 2014; Nap, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
az oldatállapotú NMR különleges előnye, hogy a fehérjéket natív-szerű oldatállapotban tanulmányozzák, ahol több konformáció között interkonvertálódhatnak., A membránfehérjéket azonban megfelelő membránmimetikumban kell oldani, amely fenntartja a natív struktúrát és dinamikát. Különböző lehetőségek közé tartozik a mosószer micellák, amphipolok, bicelles, nanodiscs, SMALPs, és lipid hólyagok, amelyek mindegyike saját előnyei és hátrányai (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Gyakran szükség van különböző szolubilizációs stratégiák tesztelésére egy adott fehérjemintára a stabilitás, a jelintenzitás és a felbontás, valamint a natív szerkezet/aktivitás érdekében., Az összes membránmimetika tekintetében két fontos szempont az (1) egységes és kis részecskeméret és (2) nagyfokú deuteráció.
a magas szintű deuteráció, mind a membránon belül, mind a proteinben, kritikus fontosságú a spektrumban jelen lévő 1H jelek számának csökkentése (beleértve az intenzív lipideket is), valamint a mintában fennmaradó NMR-aktív pörgetések relaxációs jellemzőinek javítása érdekében., Míg a deuteráció a deuterált vegyületek megvásárlásával/szintézisével lehetséges a membrán utánzására, az 1H 2H helyettesítése fehérjékben bioszintetikus beépülést igényel. Az eukarióta expressziós rendszerekben végzett gerinchálózati kísérletekhez az összes amid (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) vagy speciálisan jelölt aminosavak hozzáadásával (Isogai et al., 2016)., A metilcsoportok esetében a megfelelően jelölt aminosavakat vagy aminosav-prekurzorokat (különösen az alfa-keto savakat) a növekedési közeghez lehet biztosítani, hogy több aminosav (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind izoleucin δ1 metil-csoportok különösen hasznos, mivel (1) a rengeteg Ile maradékok a beépített membrán fehérjék beleértve határok között mozog (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) a távol pályára 13C váltás a izoleucin δ1 metil-csoportok , helyezzük el őket egy különösen ritkán látogatott régió 2D 13C/1H spektruma, (3) a hiányát kell stereospecifically rendelni ezeket a metil-csoportok eltérően-Val, valamint Lej, valamint (4) a jelenléte több, szabadon forgatható kötvények között a metil-csoport, illetve a fehérje gerincét, amely jelentős függetlenségét dynamics ezeken az oldalakon (Kasinath et al.,, 2013).
míg a fent említett címkézési stratégiák közül sok jól fejlett az E. coli esetében, sok integrált membránfehérje csak magas szinten fejezhető ki eukarióta gazdaszervezetekben. Ezek közül a metilotróf élesztő Pichia pastoris kényelmes gazdaszervezet az eukarióta membránfehérjék heterológ expressziójához és izotópos címkézéséhez (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Előnye a Pichia tartalmazza gyors genetikai manipuláció, magas hozamok rekombináns fehérje, létezését poszt-transzlációs módosítás (PTM), valamint a kísérő gépek szükséges eukarióta membrán fehérjék, valamint a képesség, hogy a nő meghatározott minimális média, amely lehetővé teszi perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). A Pichia egységes izotópos címkézése jól megalapozott (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‘ Leary, 2004)., Ezt a munkát kibővítettük azáltal, hogy bemutattuk a δ1-metil-izoleucin 1H címkézését perdeuterált háttérben, címkézett α-ketobutirát (~ 50% címkézés, ~ 90% deuteráció) hozzáadásával a erősen deuterált növekedési közeghez (Clark et al., 2017, 2015). Ezzel szemben egyidejű címke a leucin δ – s valin γ-metil-csoportok α-ketoisovalerate nem hatékony, de hozzáadásával érhetünk el jelölt valin közvetlenül a növekedés média vagy módosítása, kultúra feltételek (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., A Pichia könnyen felvehet további aminosavakat a táptalajból, általános korrelációval a felvételi hatékonyság és a De novo típusú aminosav szintetizálásának energetikai költsége között (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Miután azonban felvétele a sejtekbe, jelölt aminosavak beépíthetők metabolikus (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), hígítás jelet a kívánt aminosavak, valamint bonyolítja adatok elemzése izotóp rejtjelező., Alternatív megoldásként az auxotróf törzsek kifejleszthetők egy adott aminosav címkézésére; azonban ügyelni kell arra, hogy megerősítsék, hogy más anyagcsere-útvonalakon nem jelentkeznek a célon kívüli hatások (Whittaker, 2007).
itt részletes protokollokat biztosítunk az ilyen U-2h (13C, 1h-Ile δ1 metil)-címkével ellátott integral membrán fehérjék Pichia-ban történő túlzott expressziójával, az emberi adenozin A2A receptor modellrendszerként történő felhasználásával., Mi a további részletek, hogy az ilyen minták használható megoldás NMR vizsgálatok a megszerzése egyszerű 13C/1H HMQC spektrumok, kémiai beosztást az oldal irányított mutagenitási, hogy elemzések 1H–1H kereszt-relaxációs mérések gyors oldallánc dynamics.