szénnel megfosztott magzati borjú szérum (Lásd még Ref. 3)
1
adjunk hozzá 250 mg szenet és 25 mg dextrán T-70-100 ml magzati borjúszérumot (FCS).
2
inkubáljuk 56°C-on 30 percig.
3
centrifuga 3000-4000 fordulat / perc sebességgel 30 percig szobahőmérsékleten.
4
vigye át a felülúszót friss vödörbe.
5
ismételje meg az előző lépéseket.
6
szűrje le a felülúszót egy előszűrőn keresztül (AP típus; Millipore, Bedford, MA) a szén eltávolításához.
7
szűrjük át az oldatot egy 0.,45-μ m pórus méretű szűrő (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
-20°C-on tárolja az aliquotokat.
zselatin (10 × készlet)
1
készítsen 1% (w/v) zselatinoldatot (G-2500; Sigma, St. Louis, MO)
2
autokláv 20 percig.
3
4°C-on tárolandó.
zselatinnal bevont edények/palackok
1
a zselatinkészletet 10-szer hígítsuk fel.
2
pipetta ezt az oldatot az edényekre, hogy teljesen lefedje az edény felületét (1, 5-2 ml 6 cm-es edényenként).
3
hagyja az edényeket 2 órán át szobahőmérsékleten. Ennek az eljárásnak a felgyorsítása érdekében az inkubátorban 37°C-on 1 órán keresztül lehet elhelyezni.,
4
szívja be az edényeket.
5
Csomagolja az edényeket alumíniumfóliába, és tárolja szobahőmérsékleten vagy 4°C-on.
HEBS puffer (10× készlet)
1 2
adjon hozzá dupla desztillált vizet 975 ml-re.
3
állítsa a pH-értéket 7, 05-re, a térfogatot 1000 ml-re.
4
Autoklávozza az oldatot, és 4°C-on tárolja.
5
használat előtt szűrt glükózoldatot adunk a pufferhez (lásd 2× HEBS készítmény).
HEBS (2×)
1
a HEBS 10× állományt öt alkalommal steril H2O-val hígítsuk.
2
adjunk hozzá 0,2 ml szűrt glükózoldatot (1 g/ml) 100 ml-re (végső koncentráció, 10 mM).,
3
állítsa a pH értéket 7,05–7,08 értékre. Ez a lépés elengedhetetlen a Ca–DNS komplex kialakulásához.
4
sterilizálja az oldatot szűréssel.
foszfát-pufferelt sóoldat (PBS) kalcium és magnézium nélkül (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Media
normál közeg: nem hő-inaktivált FCS-vel és fenolvörös közeggel készítve
szteroid-szegényített közeg: szénnel, fenolvörös nélkül. Ezt a tápközeget csak akkor használják, ha a szérumban általában jelen lévő hormonok hatását meg kell vizsgálni.,
transzfekciónként használt plazmid mennyisége
Reporter plazmid konstrukció, 6,5 µg
expressziós vektor, 1,0 µg
expressziós plazmid a transzfekciós hatékonyság kontrolljaként, 0,5 µg
ha a DNS teljes mennyisége kevesebb, mint 8-10 µg, a hordozó DNS–t (plazmid vagy hering spermium DNS) hozzá kell adni a jó Ca-DNS Csapadék eléréséhez
lízis puffer