… alapú BACTOSCAN FC, amely etidium-bromidot használ a baktériumok tejben való foltolására, 8 perc (5, 30) után eredményt ad. A nyers és ultramagas hőmérsékletű tejben a tbc mérésére szolgáló áramlási – citometriás technikát a Syto BC folttal szintén leírták (16). Ezek a technikák azonban vagy nagyon specifikusak,csak egy faj kimutatására, vagy nem specifikusak, minden baktérium kimutatására., A tejben lévő baktériumok nagyobb csoportokba, például gram-pozitív és gram-negatív baktériumokba történő differenciálására szolgáló áramlási citometriás technikákat még nem írtak le. A Gram-festést először 1883-ban írta le Christian Gram kollégája, Carl Friedlander, a baktériumokat két csoportra osztva, majd 1884-ben ismét Christian Gram (12, 14). A hagyományos Gram-festési eljárás magában foglalja a foltok crystal violet és safranin. A csúszdán lévő hőre rögzített sejteket kék-ibolyaszínű, kristály ibolyával festik, majd etanollal kezelik őket., A Gram-negatív baktériumokat etanollal színesítik, míg a gram-pozitív baktériumok kristály ibolyával festettek. A továbbiakban a safranint a gram – negatív baktériumok ellen használják, így ez a csoport rózsaszínű megjelenést kölcsönöz. Számos alternatív megközelítést jelentettek a Gram-reakció azonosítására. Széles körben alkalmazzák azt a módszert, amelyben a baktériumok kolóniáját 3% – os kálium-hidroxidnak vetik alá. A kálium-hidroxid nagy koncentrációja gram-negatív baktériumokat lizál, felszabadítva a DNS-t a sejtekből, amit megerősíthetünk egy viszkózus húr húzásával a kolóniából (15, 26)., Leírtak egy alternatív Gram-festési technikát fluoreszcein konjugált lektin búzacsíra agglutininnal (WGA) kombinált epifluoreszcenciára és fáziskontraszt mikroszkóppal (29). A WGA a sejtfal pep-tidoglikán rétegében kötődik az N – acetil-glükózaminhoz. Gram-negatív baktériumok egy réteg lipopolysaccharide, amely a sejtfal ezért nem festett WGA, míg a gram-pozitív baktériumok festett WGA, mivel nem egy lipopolysaccharide réteg., Ezek az eredmények érzéketlenséget mutattak a kultúra korára, ami azt jelentette, hogy ezt a foltot közvetlenül a mintákon lehet használni a minta prekultivációja nélkül. A WGA technika modi fi ed változatát leírták olyan nem élelmiszer-környezetben található baktériumok esetében, amelyekben a baktériumokat fi lter-en immobilizálják, mossák, majd WGA-val festik (11). Néhány Gram-festési technikát javasoltak az fl ow citometriához is. Az egyik a floreszcens lipofil foltot, a rho – damine 123-at használja, amely szelektíven foltolja a gram-pozitív baktériumokat., A gram-negatív baktériumok lipopoliszacharidrétege megelőzi a rodamin 123 (1, 28) belépését. Egy másik hasonló technika ötvözi a két fluoreszkáló DNS-kötő foltot, a SYTO 13-at és a hexidium-jodidot (HI). A SYTO 13 egy membránáteresztő folt, a HI-t pedig a gram-negatív baktériumok lipopoliszacharidrétege blokkolja, így csak Gram-pozitív baktériumokra és gram-negatív baktériumokra áteresztő, de stabilizált lipopoliszacharidréteggel (22). A lipopoliszacharid réteg törékeny jellege miatt azonban úgy gondolják, hogy ezek a technikák nem alkalmasak kultiválatlan mintákra., A jelen munka célja egy Gram-festési technika kifejlesztése volt, amely a baktériumok WGA-val és HI-vel történő festésén alapul, majd ezt követte az fl ow citometriás detektálás. A technikát a tejhez társuló baktériumokon (19, 20) vizsgálták a sta-tionáris fázisban, majd 6, 12 és 48 óra inkubálás után labo – ratory közegben. Továbbá, a módszert teszteltük állomás-ary-fázis kultúrák, amelyek tárolták 24 h Ϫ 18 ° C-on, 14 napig 5 ° C-on végül, a technikát alkalmazták ömlesztett tartály tej tüskés ismert baktériumok., A Gram-pozitív és gram-negatív baktériumok precultiváció nélküli ömlesztett tartálytejben történő differenciálódásának technikája lesz a végső ap-plikáció. Az 1. ábra a KCl koncentrációnak a WGA gram-pozitív baktériumokhoz való kötődésére gyakorolt hatását mutatja M. luteus és S. uberis , amikor a baktériumokat egyedül a WGA festi, kivéve a HI-t. A hisztogramokban a zaj balra látható, ahol alacsony floreszcens intenzitású események halmozódtak fel (egy thresh – old-ot használtak a zaj nagy részének kivágására)., Amikor a baktériumokat megfestik, hogy megkülönböztessék őket a zajtól, akkor a zajtól teljesen elválasztott csúcsként jelennek meg. 0 M KCl használatával a két baktérium egyike sem volt elég foltos ahhoz, hogy elkülönítse őket a zajtól. 1 M KCl alkalmazásával mindkét baktérium esetében fokozott fl uores – cence intenzitást figyeltek meg. M. luteust ezután elválasztották a zajtól, S. uberis csak kissé túlszárnyalta a zajt. A KCl-koncentráció 3 M-re történő növelése tovább javította a WGA kötődését (magasabb FL uoreszcencia-intenzitást) ezekhez a baktériumtörzsekhez, különösen M. luteus esetében ., A mikroszkópos megfigyelések azt mutatták, hogy a gram-pozitív baktériumokat a WGA festette, míg a gram-negatív bacte – ria-t a WGA nem festette. HI festette mind a gram-pozitív, mind a gram-negatív baktériumokat. A 2.ábra a gram-pozitív M. luteus és a gram-negatív E. coli keverékének (1:1) festésére mutat példát mind a WGA, mind a HI esetében. A festés eredményeként M. luteus zöld felülettel (WGA) és vörös citoplazmával (HI) jelent meg, míg az E. coli csak vörös citoplazmával jelent meg. E. coli (M. coli) tenyészetek izometrikus analízise, luteus, és ezek keveréke (1:1) Az ábrán látható. 3. E. coli mérése önmagában (ábra. 3A), az események 100% – a volt jelen a gram-negatív régióban. Csak M. luteus számára (ábra. 3B), az események 99%-a a gram-pozitív régióban volt, az események 1%-a pedig a gram-negatív régióban. Amikor E. coli és M. luteus tenyészeteket kevertek össze (1.ábra). 3C), az események 50% – át figyelték meg minden régióban. A 12 baktériumtörzs mindegyikét két példányban mértük 6,12, 24 és 48 óra inkubálás után. Minden mérésből 100 eseményt használtak a számításokhoz. A Füge., 4 egy összeállított parcellát mutatunk be, amely mind a 800 eseményt tartalmazza a 48 órás inkubáció során vizsgált 12 baktériumtörzs mindegyikére (összesen 9600 esemény). Minden baktériumtörzs külön színnel van ellátva. A Gram-pozitív és gram-negatív baktériumok elválasztására számított legjobb sor látható. Összességében a vonal biztosította az események 97% – ának helyes értelmezését. Az egyes törzsekre helyesen értelmezett sejtek százalékos aránya cal-culált volt, és az 1. táblázat tartalmazza. E. cloacae , E. coli , K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae, S., a dys-galactiae és az S. uberis szinte minden sejtet ( Ͼ 96%) helyesen értelmeztek minden inkubációs idő alatt. A B. cereus, P. fl uores-cens és P. putida esetében a sejtek 93% – át 12 és 24 óra inkubálás után , míg 6 és 48 óra inkubálás után a sejtek mindössze 75-89% – át értelmezték helyesen. A 2. táblázatban a különböző tárolási körülményeknek kitett cul-tures fl ow – citometriás elemzéseinek eredményeit mutatjuk be., Amikor a tenyészeteket 14 napig 5 ° C-on tárolták, úgy tűnt, hogy a festési technika a kultúra kora, különösen a gram-negatív baktériumok esetében. A helyesen értelmezett sejtek átlagos százaléka 86% volt. Az E. coli, az M. luteus , az S. agalactiae , az S. dysgalactiae és az S. uberis esetében a legtöbb sejtet ( Ͼ 97%) helyesen értelmezték. A B. cereus , az E. cloacae , a K. oxytoca , az L. lactis és az S. aureus esetében a 76-89% – ot helyesen értelmezték , a P. FL uorescens és a P. putida esetében pedig a fi gues 58, illetve 68% volt., Úgy tűnt, hogy a fagyasztás nem fl uence – ben a foltos technika. Ϫ 18 ° C-on 24 órán át történő tárolás után a sejtek 98% – át helyesen értelmezték az E. cloacae , az E. coli , a K. oxy-toca , a L. lactis , a P. putida , az S. aureus , az S. agalactiae , az S. dysgalactiae és az S. uberis esetében . A B. cereus és a P. fl uorescens esetében a fi gures 83, illetve 82% volt. Az 5. ábra az ömlesztett tartálytejhez hozzáadott S. aureus és E. coli fl-citometriás anal – yses izometrikus parcelláit mutatja. S. aureus (ábra. 5A), az események 98%-a a gram-pozitív régióban volt, az események 2%-a pedig a gram-negatív régióban., Az E. coli (ábra. 5B), az események 96% – a a gram-negatív régióban volt, az események 4%-a pedig a gram – posi-tive régióban. A tejben jelen lévő természetes baktériumok hozzájárulása kevesebb, mint 0,1% volt. A KCL nagy koncentrációjának hozzáadása a festési oldathoz javította a WGA azon képességét, hogy Gram-pozitív baktériumokat foltoljon. Lehetséges magyarázat az, hogy a gram-pozitív baktériumok teikósavakkal vannak összekötve, amelyek merőlegesen kapcsolódnak a sejtfalukhoz, ami néhány gram-pozitív baktérium esetében megakadályozhatja a WGA hozzáférését a sejtfalhoz., Ha a KCL koncentrációja alacsony, akkor a teikósavak szerkezete merev, de a KCl koncentrációjának növelésével a szerkezet meglazul, mivel a káliumionok kiküszöbölik a teikósavak negatív töltését, ami a szerkezet összeomlását okozza (8, 9). A teichoic savak összetétele és szerkezete gram-pozitív SPE – cies (24) között változik, ami megmagyarázhatja, hogy a KCL concen – tration 1-ről 3 M-re történő növekedése miért volt nagyobb hatással M. luteusra, mint az S. uberisre . A jelen munkában 3 M KCl-t használtunk a WGA Gram-pozitív baktériumokhoz való kötődésének maximalizálására., A teikoesavak szervezésének kiküszöbölésére szolgáló technikákat csak mikroszkopikus alkalmazások esetén jelentettek előzetesen. Ezek a technikák közé tartozik az ozmium – tetroxid fi xation fol használata aceton hozzáadásával és elpárologtatásával (2), valamint a baktériumok Fi XA – tionjának mikroszkopikus dián történő hevítése (29). Ezeket a kezeléseket azonban nem lehetett figyelembe venni a jelen vizsgálatban, mivel a dehidrációs lépés nem alkalmas fl ow citometriára., A Gram-festési technika megbízható eredményeket mutatott minden törzs esetében 6, 12, 24 és 48 óra inkubáció után, amelyre szinte az összes (97%) sejtet helyesen értelmezték. Ezek az eredmények a WGA Gram – festési módszer fi kötéseihez alakulnak át …