A gombákból származó genetikailag kódolható biolumineszcens rendszer

• biolumineszcencia jelensége
• gombás luciferin bioszintézis
• gombás luciferáz

biolumineszcencia jelensége természetes jelenség, a fény kibocsátás eredő oxidációs szubsztrátja, luciferin, katalizált egy enzim, luciferáz. Számos faj biolumineszcens a természetben (1); sokan közülük a fénykibocsátás képessége biológiájuk meghatározó jellemzője (2⇓-4). A természetes biolumineszcens reakcióknak az élő rendszerekbe történő mesterséges integrálása szintén a molekuláris és sejtbiológiában széles körben használt jelentési eszközré vált (5, 6)., A természetes biolumineszcens rendszerek azonban biokémiai szinten továbbra is gyengén jellemezhetők, korlátozva a szélesebb körű alkalmazást. A természetben vélt legalább 40 biolumineszcens rendszerből (9) csak 9 luciferint és 7 luciferáz géncsaládot írtak le (7, 8). Sajnálatos módon csak egyetlen biokémiai kaszkádot írtak le a széles körben elterjedt metabolittól a luciferinig (10). A leírt útvonal bakteriális, és korlátozott alkalmazás eukariótákban (11)., Az eukarióta biolumineszcens rendszerek egyikét sem írták le elegendő részletességgel ahhoz, hogy egy másik szervezetben kifejeződjenek, vagy mesterséges autonóm biolumineszcens organizmusokat hozzanak létre. Itt leírjuk a Neonotopanus Nambi gomba biolumineszcenciájáért felelős kulcsfontosságú gének működését és evolúcióját, és megmutatjuk, hogy a gombagének expressziója elegendő az autonóm biolumineszcens eukarióták méréséhez.

az Agaricales rendjébe tartozó mintegy 100 gombafaj ugyanabból a biokémiai reakcióból bocsát ki fényt (12)., Bár a biolumineszcencia ökológiai szerepe nem teljesen ismert, bizonyíték van arra, hogy a gombák felhasználhatják a spórákat terjesztő rovarok vonzására (13). Gombás biolumineszcencia jelensége volt ismert, hogy kihasználja legalább négy összetevője van: a molekuláris oxigén; a luciferin, amelyet a közelmúltban azonosították 3-hydroxyhispidin ; valamint két, korábban leíratlan kulcsfontosságú enzimek, egy NAD(P)H-függő hydroxylase egy luciferáz (15, 16).

a gombás biolumineszcens út enzimjeinek azonosításához először a luciferáz gén izolálására összpontosítottunk. Az N kifejezésével., Nambi cDNA könyvtár Pichia pastoris és permetezés agar lemezek szintetikus 3-hidroxihispidin, azonosítottunk és szekvenált lumineszcens élesztő kolónia kifejező luciferáz gén (SI függelék, füge. S1 és S13). Az N. Nambi luciferáz, nnLuz, egy 267-aa fehérje (SI függelék, ábra. S2), és nincs leírt homológja vagy kifejezett szekvencia hasonlósága a konzervált fehérje doménekkel, ami egy új fehérjecsaládot képvisel.

a másodlagos metabolitokat szintetizáló enzimeket kódoló géneket gyakran csoportosítják gombás genomokban (17)., Feltételeztük, hogy ez a helyzet a biolumineszcens kaszkád enzimjeire, mert úgy gondolják, hogy a kaszkád megmarad a biolumineszcens gombák között (12). Így kerestük a luciferin bioszintézishez kapcsolódó géneket a luciferáz gén közelében az N. Nambi genomban. Az N. nambi mellett a Neonotopanus gardneri, a Mycena citricolor és a Panellus stipticus biolumineszcens gombák genomjait és transzkriptómáit is szekvenáltuk, és összehasonlítottuk azokat a biolumineszcens és nembiolumineszcens gombák nyilvánosan elérhető genomszekvenciáival (18, 19)., Megállapítottuk, hogy a luciferáz egy megőrzött géncsoport tagja, amely legalább két másik gént tartalmaz: h3h és hisps (ábra. 1 B és C, valamint S1–S3 adatkészletek).

a H3H gén szekvencia hasonlóságot mutatott a 3-hidroxi-benzoát 6-monooxigenázokkal, olyan enzimekkel, amelyek NADH és molekuláris oxigén alkalmazásával katalizálják a 3-hidroxi-benzoát oxidációját. Ez a reakció megegyezik azzal, amely átalakítja hispidin luciferin (ábra. 1A); így feltételeztük, hogy a hispidin-3-hidroxiláz (H3H) H3H génkódjai, az előre jelzett hidroxiláznak megfelelő enzim (15)., Mi a klónozott gén a N. nambi találtam, hogy a P. pastoris kolóniák kifejező mindkét nnluz, valamint nnh3h fényt bocsátanak ki, amikor permetezni luciferin prekurzor hispidin, ellentétben a kontroll kolóniák kifejező nnluz egyedül (SI Függelék, Füge. S14 és S17) – megerősítve, hogy az nnH3H a hispidint luciferinné alakítja.

the hisps gene (Fig. 1C) a poliketid-szintáz család egy tagját kódolja, olyan enzimeket, amelyek másodlagos metabolitokat termelnek az élet fája különböző szervezeteiben (20)., A poliketid-szintázok általában malonil-fajtákat adnak a növekvő szénlánchoz; így a hispidin α-Piron jellege azt sugallta, hogy bioszintézisét a caffeinsavból származó poliketid-szintáz hajthatja végre két malonil-egység Hozzáadási ciklussal, amelyet laktonizáció követ (ábra. 1a és SI függelék, ábra. S3). A nagy moduláris poliketid-szintázok tevékenységükhöz poszttranszlációs módosításokat igényelnek (21), például egy foszfopanteteinil-csoport átvitelét az acil-hordozó fehérje tartomány konzervált szerinmaradványára., Annak tesztelésére, hogy a hisps gén képes-e luciferin prekurzort előállítani egy heterológ rendszerben, integráltuk a hisps, nnluz és nnh3h géneket az Aspergillus nidulans 4′ – foszfopanteteinil-transzferáz génnel npga a P. pastoris genomjába. Caffeinsavat tartalmazó közegben tenyésztve mind a négy gént kifejező élesztők szabad szemmel fényt bocsátanak ki (ábra. 3A), míg az npgA vagy hisps génekkel (SI függelék, füge) nem rendelkező törzsekben nem figyeltek meg jelentős fénytermelést. S15 és S17)., Ezért a hisps katalizálja a hispidin szintézisét a caffeinsavból, lezárva a reakciók láncát (a” caffeinsav ciklus”) egy közös celluláris metabolitból, ismert bioszintézissel eukarióta luciferinre.

néhány biolumineszcens gombafajban a genomikus klaszter egy vagy két további gént tartalmaz (ábra. 1C): az egyik a citokróm P450 családba, a másik a fumarilacetoacetát hidrolázok családjába tartozik., Az utóbbi (cph), valószínűleg kódolja egy caffeylpyruvate hidroláz (Adatkészlet S4) részt vesz oxiluciferin újrahasznosítás, összhangban caffeylpyruvate, a gombás oxiluciferin, hogy hidrolizált, hogy caffeate, valamint piruvát által hidroláz jelen gombás nyers kivonat (22).

a géncsoport megőrzése azt sugallja, hogy a biolumineszcens organizmusok más csoportjaival (23) ellentétben a biolumineszcencia csak egyszer fejlődött ki gombákban, a luz, h3h és a hisps gének pedig gén duplikációk révén jelentek meg. Rekonstruált filogenetikai fák luz, h3h, és hisps gének (SI függelék, füge., S4-S6) és az Agaricales rendjébe tartozó faj (2. 2) feltárja a biolumineszcencia kaszkád fejlődését a gombákban. A gombás biolumineszcencia kaszkád elsődleges Luz enzimje az Agaricales tövében lévő gén duplikációjával jött létre, amelyet néhány millió évvel később a H3H és a hisps duplikációja követett. Érdekes módon egy nagy kládon belül sok faj nembiolumineszcens, a biolumineszcens fajokban pedig a hisps homológoknak nincs két doménje, a ketoreduktáz és a dehidratáz domén (SI függelék, ábra). S6)., Valószínű, hogy ezeknek a funkcionális domaineknek a elvesztése a biolumineszcens fajok közös ősében kedvelte az α-pironok ősei által történő előállítását, esetleg a biolumineszcencia kialakulásának utolsó lépését.

a géncsoport dinamikusan fejlődött a biolumineszcencia megszerzése után. A genomikus klaszterből származó gének legalább hat független teljes vagy részleges génvesztési eseménye a biolumineszcencia másodlagos elvesztéséhez vezetett (ábra. 2). A CPH gént behelyeztük a klaszterbe a nemmikenoid kládba, esetleg kétszer (ábra. 1)., Ez a mozaik minta hasonlít az evolúciós története fluoreszcens fehérjék (24), a másik vizuálisan megfelelő fehérje család, egy homályos biológiai szerepét, valamint azt jelezheti, hogy a szelektív által nyújtott előny biolumineszcencia jelensége a gombák attól függ, hogy egy adott, vagy átmeneti ökológiai kontextusban.

a komplex adaptációk biotechnológiai szempontból releváns megoldások forrása lehetnek., Az alapvető fotokémiai folyamatok és a proteinfejlődés természetének feltárása mellett a luciferázok a különböző kutatási csővezetékekben, diagnosztikai módszerekben és környezeti alkalmazásokban (5, 6, 25) használt reporter gének elsődleges típusai közé tartoznak. Annak megállapításához, hogy egy gombás biolumineszcens út képes-e reporter géneket biztosítani, in vitro jellemeztük az nnLuz-t, és teszteltük, hogy képes-e fényt előállítani heterológ rendszerekben.

az nnLuz fehérje 267 aminosavból áll, molekulatömege körülbelül 28,5 kDa (SI függelék, ábra. S7)., Bár sejtes lokalizációja in vivo továbbra sem ismert, a fehérje előrejelzett N-terminális transzmembrán helix, amely összhangban van a luciferáz aktivitásának kolokalizációjával oldhatatlan sejtfrakciókkal a korábbi vizsgálatokban (22). P. pastoris-ban kifejezve az nnluz-t a mikroszomális frakcióval társították(SI függelék, ábra. S8), és 520 nm-es maximummal zöld fényt bocsát ki, és spektruma megegyezik az N. Nambi micéliuméval (2.ábra). 3a és SI függelék, ábra. S9). A rekombináns nnluz optimálisan bocsát ki fényt a pH 8 körül.,0 és mérsékelt hőmérsékletek, amelyek 30 °C feletti hőmérsékleten veszítenek aktivitásából (SI függelék, ábra. S10).

az nnluz mint riporter gén heterológ rendszerekben rejlő potenciáljának teszteléséhez teszteltük expresszióját Escherichia coli, pastoris, korai Xenopus laevis embriókban és emberi sejtekben., Bár a luciferáz elsősorban a befogadási szervekben halmozódott fel, amikor baktériumokban expresszálódik (SI függelék, ábra. S7), a vadon élő nnluz-t expresszáló összes vizsgált sejt és szervezet egyértelműen biolumineszcens volt, amikor 3-hidroxihispidint adtak a közeghez (ábra. 3 és SI függelék, füge. S11 és S22). Összehasonlítottuk az nnluz-t a firefly Photinus pyralis luciferázával az egerek tumor xenograftjainak teljes testű képalkotó beállításában. Mi S. c., a beültetett egyenlő mennyiségű egér vastagbél carcinoma sejtek kifejező vagy nnluz vagy a firefly luciferáz alatt ugyanaz a szervező, beadott egy keverék a firefly pedig gombás luciferins én.p. a kapott majdnem azonos jeleket az implantátumok (Fig. 3C).

végül arra törekedtünk, hogy teszteljük, hogy a luciferin bioszintézis megvalósítható-e a koffeinsav bioszintézisét nem tartalmazó szervezetekben. Három további gén bevezetése, amelyek a tirozin, a Rhodobacter capsulatus tirozin ammónia-lyáz enzimjeit kódolják., coli 4-hidroxi-fenil-acetát 3-monooxigenáz komponensek (26), a genomjába P. pastoris törzs hordozó npgA, hisps, h3h, és luz gének eredményezett törzs, amely önállóan biolumineszcens, amikor nőtt egy szabványos élesztőközegben (SI függelék, füge. S12 és S16).

így minden vizsgált körülmények között a vad típusú N. Nambi luciferáz heterológ rendszerekben működik, ígéretes reporter génként pozicionálja magát, a gombás luciferin pedig aromás aminosavakból szintetizálható más eukariótákban., Ezenkívül a gombás luciferin vízoldható és sejtáteresztő vegyület, fénykibocsátó reakciója nem függ az ATP elérhetőségétől, így a gombás biolumineszcens rendszer vonzó A biomedikai képalkotás számos alkalmazásához. Ezenkívül különböző luciferin analógok használhatók a fénykibocsátás fokozására és a spektrumok beállítására, javítva a fény behatolását a mélyszöveti képalkotó alkalmazásokban (22).

összefoglalva bemutatjuk az enzimatikus kaszkádot, amely a gombák fénykibocsátásához vezet, amely eukarióta biolumineszcencia rendszer, a luciferin ismert bioszintézisével., Megmutattuk, hogy a luciferint a hispidin prekurzorából N. nambi H3H szintetizálja, és hogy a hispidint közvetlenül a hispidin-szintáz szintetizálja a caffeinsavból, egy széles körben elterjedt sejtes metabolitból, hatékony bioszintézissel, amelyet különböző szervezetekben értek el, beleértve az iparilag releváns élesztőtörzseket (26)., Csak két enzimatikus lépések a mainstream, az anyagcsere-folyamatokra, a gombás rendszer nagy potenciállal a szintetikus biológia hozzon létre önállóan izzó állatok, növények: fejlesztésére irányuló ilyen szervezetek eddig korlátozza a gyenge teljesítményt eukaryotes a bakteriális foszforeszkáló rendszer, az egyetlen rendszer, amely luciferin bioszintézis ismert volt (27, 28).

a gombás biolumineszcens út eukarióta szervezetekben történő feloldása lehetővé teheti olyan alkalmazások alkalmazását, ahol a szövetek vagy szervezetek önálló fénykibocsátással jelentik fiziológiai állapotuk változását., Ez tovább fokozhatja a szerves építészet következő generációjának (29) fejlődését is, ahol a géntechnológiával módosított izzó növényeket beépítik az épületekbe és a városi infrastruktúrába. Ettől eltekintve, annak érdekes evolúciós történelem, egy család luciferases, összességében az egyszerűség, a gombás foszforeszkáló rendszer az itt bemutatott molekuláris játszótér gazdaság számos lehetőséget alap-vagy alkalmazott kutatás.,