Système bioluminescent génétiquement codable à partir de champignons

• la bioluminescence
• fongiques luciférine biosynthèse
• fongiques de la luciférase

la Bioluminescence est un phénomène naturel de l’émission de lumière résultant de l’oxydation d’un substrat, la luciférine, catalysée par une enzyme, la luciférase. Une variété d’espèces sont de nature bioluminescente (1); pour beaucoup d’entre elles, la capacité d’émettre de la lumière est une caractéristique déterminante de leur biologie (2⇓-4). L’intégration artificielle de réactions bioluminescentes naturelles dans les systèmes vivants est également devenue un outil de reporting largement utilisé en biologie moléculaire et cellulaire (5, 6)., Cependant, les systèmes bioluminescents naturels restent mal caractérisés au niveau biochimique, ce qui limite une application plus répandue. Seules 9 familles de gènes de luciférines et 7 de luciférases ont été décrites (7, 8) sur au moins 40 systèmes bioluminescents que l’on pense exister dans la nature (9). Lamentablement, seule une cascade biochimique unique partant d’un métabolite répandu vers une luciférine a été décrite dans son intégralité (10). La voie décrite est bactérienne et a une application limitée chez les eucaryotes (11)., Aucun des systèmes bioluminescents eucaryotes n’a été décrit de manière suffisamment détaillée pour être exprimé dans un autre organisme ou pour créer des organismes bioluminescents artificiels autonomes. Nous décrivons ici la fonction et l’évolution des gènes clés responsables de la bioluminescence du champignon Neonothopanus nambi et montrons que l’expression des gènes fongiques est suffisante pour concevoir des eucaryotes bioluminescents autonomes.

Environ 100 espèces fongiques de L’ordre des Agaricales émettent de la lumière en utilisant la même réaction biochimique (12)., Bien que le rôle écologique de leur bioluminescence ne soit pas entièrement compris, il existe des preuves qu’il pourrait être utilisé par les champignons pour attirer les insectes diffuseurs de spores (13). On sait que la bioluminescence fongique utilise au moins quatre composants: l’oxygène moléculaire; la luciférine, qui a été récemment identifiée comme étant la 3-hydroxyhispidine ; et deux enzymes clés non décrites auparavant, une hydroxylase dépendante de la NAD(P)H et une luciférase (15, 16).

pour identifier les enzymes de la voie fongique bioluminescente, nous nous sommes d’abord concentrés sur l’isolement du gène de la luciférase. En exprimant le N., nambi bibliothèque d’adnc dans Pichia pastoris et la pulvérisation des plaques de gélose avec la synthèse de la 3-hydroxyhispidin, nous avons identifié et séquencé luminescent, colonies de levure exprimant le gène de la luciférase (SI l’Annexe, les Figues. S1 et S13). La N. Nambi luciférase, nnLuz, est une protéine 267-aa (annexe SI, Fig. S2) et n’a pas d’homologues décrits ou de similitude de séquence prononcée avec les domaines protéiques conservés, représentant une nouvelle famille de protéines.

Les gènes codant pour les enzymes qui synthétisent les métabolites secondaires sont souvent regroupés dans les génomes fongiques (17)., Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être le cas pour les enzymes de la cascade bioluminescente, car on pense que la cascade est conservée parmi les champignons bioluminescents (12). Nous avons donc cherché des gènes liés à la biosynthèse de la luciférine au voisinage du gène de la luciférase dans le génome de N. nambi. En plus de N. nambi, nous avons également séquencé les génomes et les transcriptomes de champignons bioluminescents Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor et Panellus stipticus et les avons comparés à des séquences génomiques accessibles au public de champignons bioluminescents et nonbioluminescents (18, 19)., Nous avons constaté que la luciférase est un membre d’un groupe de gènes conservés, qui comprend au moins deux autres gènes: h3h et hisps (Fig. 1 B et C et jeux de données S1–S3).

le gène h3h a montré une similitude de séquence avec les 3-hydroxybenzoate 6-monooxygénases, des enzymes qui catalysent l’oxydation du 3-hydroxybenzoate en utilisant le NADH et l’oxygène moléculaire. Cette réaction est identique à celle qui convertit l’hispidine en luciférine (Fig. 1A); ainsi, nous avons émis l’hypothèse que le gène h3h code pour l’hispidine-3-hydroxylase (H3H), l’enzyme correspondant à l’hydroxylase prédite (15)., Nous avons cloné le gène de N. Nambi et avons constaté que les colonies de P. pastoris exprimant à la fois nnluz et nnh3h émettent de la lumière lorsqu’elles sont pulvérisées avec de l’hispidine, précurseur de la luciférine, contrairement aux colonies témoins exprimant nnluz seules (annexe SI, Figs. S14 et S17)—confirmant que nnH3H convertit l’hispidine en luciférine.

le gène hisps (Fig. 1C) code un membre de la famille des polykétides synthases, des enzymes qui produisent des métabolites secondaires dans divers organismes de l’arbre de vie (20)., Ainsi, la nature α-pyrone de l’hispidine suggère que sa biosynthèse peut être effectuée par une polykétide synthase à partir de l’acide caféique par deux cycles d’addition d’unités malonyles suivis d’une lactonisation (Fig. Annexe 1A ET SI, fig. S3). Les grandes polykétides synthases modulaires nécessitent des modifications post-traductionnelles pour leur activité (21), telles que le transfert d’un groupe phosphopantéthéinyle à un résidu sérine conservé du domaine protéique porteur acyle., Pour tester si le gène hisps peut produire un précurseur de la luciférine dans un système hétérologue, nous avons intégré les gènes hisps, nnluz et nnh3h avec le gène Npga de la 4′-phosphopantéthéinyl transférase D’Aspergillus nidulans dans le génome de P. pastoris. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu contenant de l’acide caféique, les levures exprimant les quatre gènes émettent une lumière visible à l’œil nu (fig. 3A), alors qu’aucune production significative de lumière n’a été observée chez les souches dépourvues de gènes npgA ou hisps (annexe SI, Figs. S15 et S17)., Par conséquent, hisps catalyse la synthèse de l’hispidine à partir de l’acide caféique, fermant la chaîne de réactions (le « cycle de l’acide caféique”) d’un métabolite cellulaire commun avec une biosynthèse connue à une luciférine eucaryote.

chez certaines espèces de champignons bioluminescents, le groupe génomique accueille un ou deux gènes supplémentaires (Fig. 1C): l’un appartenant à la famille du cytochrome P450, et l’autre appartenant à la famille des fumarylacétoacétate hydrolases., Cette dernière (cph) code probablement une caféylpyruvate hydrolase (jeu de données S4) impliquée dans le recyclage de l’oxyluciférine, compatible avec le cafféylpyruvate, l’oxyluciférine fongique, étant hydrolysé en caféate et pyruvate par une hydrolase présente dans des extraits bruts fongiques (22).

la Conservation du groupe de gènes suggère que, contrairement à d’autres groupes d’organismes bioluminescents (23), la bioluminescence n’a évolué chez les champignons qu’une seule fois, les gènes luz, h3h et hisps émergeant par duplication de gènes. Arbres phylogénétiques reconstruits pour les gènes luz, h3h et hisps (annexe SI, fig., S4–S6) et l’arbre des espèces de L’ordre des Agaricales (fig. 2) révéler l’évolution de la cascade de bioluminescence chez les champignons. L’enzyme luz primaire de la cascade de bioluminescence fongique est apparue par une duplication de gènes à la base des Agaricales suivie de la duplication de h3h et de hisps quelques millions d’années plus tard. Fait intéressant, de nombreuses espèces d’un grand clade codant hisps sont nonbioluminescentes, et les homologues hisps des espèces bioluminescentes manquent de deux domaines, les domaines kétoréductase et déshydratase (annexe SI, Fig. S6)., Il est probable que la perte de ces domaines fonctionnels chez l’ancêtre commun des espèces bioluminescentes ait favorisé la production d’α-pyrones par les hisps ancestraux, fournissant peut-être l’étape finale pour l’émergence de la bioluminescence.

le groupe de gènes a continué à évoluer dynamiquement après l’acquisition de la bioluminescence. Au moins six événements indépendants de perte complète ou partielle de gènes du groupe génomique ont entraîné une perte secondaire de bioluminescence (Fig. 2). Le gène cph a été inséré dans l’amas dans le clade des non-mycénoïdes, peut-être deux fois (Fig. 1)., Ce motif de mosaïque ressemble à l’histoire évolutive des protéines fluorescentes (24), une autre famille de protéines visuellement pertinente dont le rôle biologique n’est pas clair, et peut indiquer que l’avantage sélectif fourni par la bioluminescence chez les champignons dépend d’un contexte écologique spécifique ou transitoire.

des adaptations complexes peuvent être une source de solutions biotechnologiques pertinentes., En plus de révéler la nature des processus photochimiques de base et de l’évolution des protéines, les luciférases font partie des principaux types de gènes rapporteurs utilisés dans divers pipelines de recherche, méthodes de diagnostic et applications environnementales (5, 6, 25). Pour déterminer si une voie fongique bioluminescente peut fournir des gènes rapporteurs, nous avons caractérisé nnLuz in vitro et testé sa capacité à produire de la lumière dans des systèmes hétérologues.

la protéine nnLuz se compose de 267 acides aminés et a une masse moléculaire d’environ 28,5 kDa (annexe SI, Fig. S7)., Bien que sa localisation cellulaire in vivo reste inconnue, la protéine a une hélice transmembranaire N-terminale prédite, ce qui correspond à la colocalisation de l’activité de la luciférase avec des fractions cellulaires insolubles dans des études antérieures (22). Lorsqu’il est exprimé dans P. pastoris, nnLuz a été associé à la fraction microsomique (annexe SI, Fig. S8) et de lumière verte émise avec un maximum à 520 nm et un spectre identique à celui du mycélium N. nambi (fig. Annexe 3A et SI, fig. S9). Le nnluz Recombinant émet de la lumière de manière optimale à un pH d’environ 8.,0 et des températures modérées, perdant son activité à des températures supérieures à 30 °C (annexe SI, Fig. S10).

pour tester le potentiel de nnluz en tant que gène rapporteur dans les systèmes hétérologues, nous avons testé son expression dans Escherichia coli, P. pastoris, les premiers embryons de Xenopus laevis et des cellules humaines., Bien que la luciférase s’accumule principalement dans les corps d’inclusion lorsqu’elle est exprimée dans les bactéries (annexe SI, Fig. S7), toutes les cellules et organismes testés exprimant le nnluz de type sauvage étaient clairement bioluminescents lorsque la 3-hydroxyhispidine a été ajoutée au milieu (Fig. 3 et si annexe, fig. S11 et S22). Nous avons également comparé nnluz qualitativement avec la luciférase de la luciole Photinus pyralis dans une configuration d’imagerie du corps entier de xénogreffes tumorales chez la souris. Nous s.c., implanté des quantités égales de cellules de carcinome du côlon murin exprimant soit nnluz ou luciférase luciférase de luciole sous le même promoteur, injecté un mélange de luciférines luciférines et fongiques I. P., et obtenu des signaux presque identiques à partir des implants (Fig. 3C).

enfin, nous avons cherché à tester si la biosynthèse de la luciférine peut être réalisée chez des organismes dépourvus de biosynthèse de l’acide caféique. Introduction de trois gènes supplémentaires codant pour les enzymes de la biosynthèse de L’acide caféique à partir de la tyrosine, Rhodobacter capsulatus tyrosine ammoniac lyase et deux E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase composants (26), dans le génome de la souche de P. pastoris portant npgA, hisps, H3H, et les gènes luz a donné lieu à une souche qui était autonome bioluminescent lorsqu’il était cultivé dans un milieu de levure standard (Annexe SI, Figs. S12 et S16).

ainsi, dans toutes les conditions testées, la N. Nambi luciférase de type sauvage est fonctionnelle dans les systèmes hétérologues, se positionnant comme un gène rapporteur prometteur, et la luciférine fongique peut être synthétisée à partir d’acides aminés aromatiques chez d’autres eucaryotes., De plus, la luciférine fongique est un composé soluble dans l’eau et perméable aux cellules, et sa réaction d’émission de lumière ne dépend pas de la disponibilité de L’ATP, ce qui rend le système fongique bioluminescent attrayant pour de nombreuses applications en imagerie biomédicale. En outre, divers analogues de la luciférine peuvent être utilisés pour améliorer l’émission de lumière et régler ses spectres, améliorant ainsi la pénétration de la lumière dans des applications d’imagerie tissulaire profonde (22).

En conclusion, nous présentons la cascade enzymatique qui conduit à l’émission de lumière chez les champignons, qui est un système de bioluminescence eucaryote avec une biosynthèse connue de la luciférine., Nous avons montré que la luciférine est synthétisée à partir de son précurseur l’hispidine par N. nambi H3H et que l’hispidine peut être directement synthétisée par l’hispidine synthase à partir de l’acide caféique, un métabolite cellulaire répandu avec une biosynthèse efficace qui a été réalisée dans divers organismes, y compris des souches de levure industriellement pertinentes (26)., À seulement deux étapes enzymatiques des voies métaboliques principales, le système fongique a un potentiel élevé pour la biologie synthétique de créer des animaux et des plantes brillants de manière autonome: les tentatives de développement de tels organismes ont jusqu’à présent été limitées par les mauvaises performances chez les eucaryotes du système bioluminescent bactérien, le seul système pour lequel la biosynthèse de la luciférine était connue (27, 28).

la Reconstitution de la voie bioluminescente fongique chez les organismes eucaryotes pourrait permettre des applications où des tissus ou des organismes signalent des changements dans leur état physiologique avec une émission de lumière autonome., Cela pourrait également faire avancer le développement de la prochaine génération d’architecture organique (29), où des plantes incandescentes génétiquement modifiées seront intégrées dans les bâtiments et les infrastructures de la ville. En dehors de cela, avec son histoire évolutive intrigante, une famille de luciférases et une simplicité globale, le système fongique bioluminescent présenté ici est un terrain de jeu moléculaire offrant de nombreuses opportunités pour la recherche fondamentale et appliquée.,