Sérum de veau foetal dépouillé de charbon de bois (Voir Aussi Réf. 3)
1
ajouter 250 mg de charbon de bois et 25 mg de Dextran T-70 à 100 ml de sérum de veau fœtal (SCF).
2
Incuber à 56°C pendant 30 min.
3
centrifuger à 3000-4000 tr / min pendant 30 min à température ambiante.
4
transférer le surnageant dans des seaux frais.
5
Répétez les étapes précédentes.
6
filtrer le surnageant à travers un préfiltre (type AP; Millipore, Bedford, MA) pour éliminer le charbon de bois.
7
Filtrer la solution à travers un 0.,Filtre à pores de 45 μ m (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
conserver les aliquotes à -20°C.
gélatine (10 × Stock)
1
faire une solution à 1% (P/v) de gélatine (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
Autoclave pendant 20 min.
3
conserver à 4°c.
plats/bouteilles enrobés de gélatine
1
diluer le bouillon de gélatine 10 fois.
2
pipeter Cette solution sur la vaisselle pour couvrir complètement la surface de la vaisselle (1,5 à 2 ml par plat de 6 cm).
3
laisser la vaisselle pendant 2 h à température ambiante. Pour accélérer cette procédure, ils peuvent être placés dans l’incubateur à 37°C pendant 1 heure.,
4
aspirer la vaisselle.
5
enveloppez les plats dans du papier aluminium et conservez-les à température ambiante ou à 4°c.
tampon HEBS (10× stock)
1 2
ajoutez de l’eau double distillée à 975 ml.
3
Réglez le pH à 7,05 et le volume à 1000 ml.
4
Autoclave la solution et la conserve à 4°c.
5
avant utilisation, une solution de glucose filtrée est ajoutée au tampon (voir préparation de 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
diluer le bouillon HEBS 10× cinq fois avec du H2O stérile.
2
Ajouter 0,2 ml d’une solution de glucose filtrée (1 g / ml) par 100 ml (concentration finale, 10 mM).,
3
ajustez le pH à 7,05–7,08. Cette étape est cruciale pour la formation du complexe Ca–ADN.
4
Stériliser la solution par filtration.
solution saline tamponnée au Phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
milieu
milieu Normal: préparé avec du FCS Non inactivé par la chaleur et du milieu avec du rouge phénol
milieu appauvri en stéroïdes: préparé avec du FCS dépouillé au charbon et du milieu sans Rouge phénol. Ce milieu n’est utilisé que lorsque l’effet des hormones, normalement présentes dans le sérum, doit être testé.,
quantité de plasmide utilisée par transfection
construction de plasmide Rapporteur, 6,5 µg
vecteur D’Expression, 1,0 µg
plasmide D’Expression comme témoin de l’efficacité de la transfection, 0,5 µg
lorsque la quantité totale d’ADN est inférieure à 8 à 10 µg, de L’ADN porteur (plasmide ou ADN de sperme de hareng) doit être ajouté
tampon de lyse