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Clostridium difficile est un agent pathogène nosocomial anaérobie sporogène associé à une diarrhée ou une colite légère à mortelle (1, 2). La colonisation de C. difficile augmente avec la durée du séjour à l’hôpital après une exposition environnementale à des spores ou un contact avec une personne infectée (3). La Contamination et la survie des spores de C. difficile sur les surfaces inanimées des hôpitaux ont été rapportées (4, 5) et il a été démontré qu’elles étaient associées à une transmission croisée (6,-8).,
L’Inactivation et l’éradication des spores de Clostridium difficile sont un défi, et plusieurs techniques relativement nouvelles ont été étudiées, telles que la vapeur de peroxyde d’hydrogène, le rayonnement UV ou les systèmes de plasma gazeux(5, 6, 9, 10). La Validation de ces techniques devrait utiliser des méthodes de récupération optimales pour mieux quantifier la destruction ou l’éradication des spores bactériennes.
diverses méthodes ont été utilisées pour détecter le C. difficile en milieu hospitalier avec des résultats variables (11, 12). Nous rapportons ici une évaluation de différentes méthodes pour détecter et récupérer C., spores difficiles provenant de matériaux couramment trouvés dans l’environnement hospitalier.
(Les données préliminaires issues de cette étude ont été présentées sous forme d’affiche au congrès européen de Microbiologie Clinique et des maladies infectieuses, Barcelone, Espagne, mai 2014.)
une souche de référence de C. difficile, ATCC 700057 (Cruinn Diagnostics, Irlande), et un isolat clinique non caractérisé (Laboratoire de Diagnostic, Hôpital Beaumont, Dublin, Irlande) ont été inclus dans l’étude. Une modification du protocole de préparation des spores de C. difficile décrit par Chilton et al. a été utilisé (13). Brièvement, C., difficile a été inoculé dans une perfusion pré-réduite de cœur cérébral complétée par de l’extrait de levure et de la L-cystéine, incubé anaérobiquement à 37°C pendant 48 h, et étalé sur 10 plaques de gélose Columbia blood (Oxoid, Royaume-Uni), qui ont été incubées anaérobiquement à 37°C pendant 10 jours (14). La croissance a été prélevée sur les plaques à l’aide d’un grattoir cellulaire et mise en suspension dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-éthanol (50% ). Les suspensions ont été incubées à température ambiante pendant 1 h avec un mélange périodique., Les suspensions de spores ont été centrifugées pendant 10 min à 16 000 × g, et les pastilles ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS. Le nombre et la pureté des spores ont été déterminés par microscopie à l’aide du kit de coloration des spores Schaeffer et Fulton (Sigma-Aldrich, Irlande). Les Suspensions ont été ajustées à une concentration d’environ 105 UFC/ml (une colonie équivaut à une spore), et des dilutions en série 1:10 ont été préparées dans le PBS.
C., difficile spore suspensions (50 µl), allant de 105 à 10 UFC/ml, ont été ajoutés en double sur des sections de 25 cm2 de tissu de matelas en polyuréthane (Meditec Medical, Irlande), polypropylène (GoodFellow Cambridge, Ltd., Royaume-Uni) et en acier inoxydable, tous décontaminés comme décrit précédemment (15). Les suspensions de spores appliquées sur les surfaces ont été séchées à l’air pendant 2 H. les surfaces ont été échantillonnées à l’aide d’écouvillons de rayonne pré-humidifiés et d’écouvillons floqués de nylon (Copan, Italie) et placées dans 3 ml de PBS. Des dilutions en série des suspensions d’écouvillon ont été inoculées sur des plaques sélectives C. difficile—C., gélose difficile base CM0601 plus supplément C. difficile SR0096 (250 mg/litre de d-cyclosérine, 8 mg/litre de céfoxitine) et 7% (vol/vol) de sang de cheval défibriné (SR0050)—fourni par Oxoid pour le dénombrement de CFU/ml. Des plaques de contact stériles (VWR) ont été versées en laboratoire avec de la gélose sélective C. difficile et appliquées sur chaque section pendant 20 s, assurant un contact ferme avec la surface. Les plaques sous-cultivées des écouvillons et des plaques de contact ont été incubées pendant une nuit en anaérobie à 37°C. le dénombrement des colonies a été effectué le lendemain., La limite de détection (LOD) a été définie comme la plus faible concentration de spores appliquée qui a été détectée par une méthode spécifique. Toutes les méthodes ont été évaluées indépendamment en ciblant l’ensemble de la section, et leurs capacités à détecter et à récupérer les spores de C. difficile ont été comparées. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 5.00. Les moyens de trois expériences indépendantes du pourcentage de récupération pour les différentes méthodes ont été analysés par l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et le test de comparaison multiple de Tukey.,
en 1983, l’un des premiers rapports comparant les méthodes de récupération des spores de C. difficile à partir d’une surface de verre de l’environnement a montré que les écouvillons, les palettes adhésives et les plaques de contact étaient de loin la méthode la plus efficace, détectant les spores à faible teneur, étant plus simple à utiliser et relativement rapide (16). Depuis lors, diverses méthodes, y compris des écouvillons, des plaques de contact, des gants et des éponges, ont été utilisées pour la recherche et les enquêtes sur les éclosions avec des résultats variables. Ici, nous démontrons que les plaques de contact ont obtenu la récupération la plus élevée de C., spores difficiles (14% à 92%) provenant de diverses surfaces, y compris le matériau du matelas, le polypropylène et l’acier inoxydable, confirmant et prolongeant les résultats de Buggy et al. (16) pour la récupération du verre. La récupération était également efficace pour les écouvillons floqués (14% à 76%), et la méthode la moins efficace était l’écouvillon de rayonne (7% à 58%) (Fig. 1A et andB).B). Le pourcentage de récupération était directement proportionnel à la taille de l’inoculum initial, c’est—à-dire qu’un inoculum de 105 UFC/ml permettait aux plaques de contact de récupérer jusqu’à 92% et aussi peu que 14% pour un inoculum de 10 UFC/ml., Les plaques de Contact ont également été les plus sensibles à la détection des spores à un inoculum minimum de 10 UFC/ml, tandis que la LD était de 102 UFC/ml pour les écouvillons floqués et de 103 UFC/ml pour les écouvillons de rayonne, mais cela n’était vrai que pour l’isolat clinique. Statistiquement, les plaques de contact étaient meilleures que les écouvillons floqués sur polypropylène pour l’isolat clinique (p < 0,05) (Tableau 1) et toujours supérieures aux écouvillons de rayonne (p < 0,05 à P < 0,001) (Tableau 1), bien qu’il n’y ait pas de différence significative entre les écouvillons floqués et les écouvillons de rayonne., Bien que l’analyse statistique n’ait révélé aucune différence significative dans les recouvrements entre toutes les surfaces étudiées, les recouvrements du matériau du matelas ont été légèrement réduits par rapport à ceux des deux autres surfaces. De plus, aucune différence statistique n’a été observée entre les deux isolats.
pourcentage de récupération des spores de Clostridium difficile de la souche de référence (A) et de l’isolat clinique (B) de trois surfaces environnementales à l’aide de plaques de contact, d’écouvillons floqués et d’écouvillons de rayonne., Les barres d’erreur représentent les erreurs types des moyennes (SEM) d’au moins trois expériences indépendantes (n ≥ 3)., »1″> la valeur P de l’analyse statistique de l’oof:
C., les spores difficiles peuvent être rejetées dans l’environnement par les patients asymptomatiques et symptomatiques et peuvent survivre jusqu’à 5 mois sur des surfaces inanimées (17). Ils résistent aux effets bactéricides de la plupart des désinfectants hospitaliers et de la plupart des autres techniques de décontamination (18). Par conséquent, les interventions doivent être surveillées dans les pièces actuellement ou précédemment occupées par des porteurs de C. difficile. Le rapport de méthodes améliorées en termes de vitesse et de sensibilité, telles que la plaque de contact et les écouvillons floqués rapportés ici, donne une estimation plus précise du C., charge difficile par rapport aux méthodes précédemment rapportées. Étant donné que le C. difficile est l’endospore la plus importante dans le milieu des soins de santé d’aujourd’hui et qu’il présente un risque d’infection important pour les patients vulnérables, il est de plus en plus nécessaire de quantifier avec précision la contamination par les spores de C. difficile dans le milieu des soins de santé. Ce serait dans le but d’évaluer de nouvelles méthodes de décontamination et de corréler les niveaux de contamination de l’environnement avec le risque d’infection et la survenue d’éclosions., Néanmoins, l’amélioration des méthodes de récupération acceptées à l’aide de matériaux qui représentent ceux trouvés dans le milieu hospitalier est une condition préalable nécessaire.