1 Introduction
Les protéines membranaires intégrales constituent une grande proportion des génomes de nombreux organismes—environ 25% du génome humain—et remplissent une gamme variée de fonctions, y compris des étapes clés dans la communication d’une cellule avec son environnement., En raison de leur importance biologique et thérapeutique (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), les protéines membranaires font l’objet de recherches biophysiques fondamentales et appliquées pour caractériser les structures tridimensionnelles, la dynamique et les interactions dans des environnements de type natif.,
la spectroscopie RMN à L’État de Solution a joué un rôle essentiel dans les études biophysiques des protéines membranaires, car les informations dynamiques et d’interaction spécifiques au site fournies par de telles approches complètent bien les données structurelles obtenues à partir de diffraction des rayons X, de cryo-EM et d’analyses computationnelles (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., De telles études sont fondamentales pour plusieurs « spectres d’empreintes digitales 2D », le plus souvent des spectres 15N/1h HSQC (heteronuclear single-quantum coherence) (pour backbone amide plus TRP, Asn et Gln sidechains) ou des spectres 13C / 1h hmqc (heteronuclear multiple-quantum coherence) pour les groupes méthyle sidechain (Pellecchia et al., 2008). Ces expériences dirigées vers le méthyle sont particulièrement avantageuses pour les grands complexes protéines/lipides membranaires à dégringolade lente; des expériences dirigées vers d’autres sites de chaîne latérale et de chaîne principale ont également été appliquées avec succès., Les expériences RMN peuvent fournir des informations sur la dynamique des protéines sur de nombreuses échelles de temps, des mouvements rapides (ps–ns) à des changements conformationnels lents (µs–ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Wand, Moorman, & Harpole, 2013)., Beaucoup de ces expériences dynamiques, utilisant souvent des groupes méthyle sidechain comme sondes, ont été adaptées et développées pour de grands systèmes biomoléculaires et peuvent être utilisées pour des protéines membranaires (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
un avantage particulier de la RMN à l’état de solution est que les protéines sont étudiées dans un État de solution de type natif où elles peuvent interconvertir entre plusieurs conformations., Cependant, les protéines membranaires doivent être solubilisées dans un mimétique membranaire approprié qui maintient la structure et la dynamique natives. Les différentes options comprennent les micelles détergentes, les amphipols, les bicelles, les nanodiscs, les SMALPs et les vésicules lipidiques, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Il est souvent nécessaire de tester différentes stratégies de solubilisation pour un échantillon de protéine donné pour la stabilité, l’intensité et la résolution du signal, et la structure/activité native., Deux considérations importantes pour tous les mimétiques membranaires sont (1) une taille de particule uniforme et petite et (2) un degré élevé de deutériation.
la deutération de haut niveau, à la fois dans la membrane mimétique et dans la protéine elle-même, est essentielle pour réduire le nombre de signaux 1H présents dans les spectres (y compris ceux des lipides, qui peuvent être intenses) et pour améliorer les caractéristiques de relaxation des spins actifs RMN restants dans l’échantillon., Alors que la deutériation est possible pour la membrane mimétique par l’achat / synthèse de composés deutérés, le remplacement de 1h par 2H dans les protéines nécessite une incorporation biosynthétique. Pour les expériences de backbone dans les systèmes d’expression eucaryotes, on peut étiqueter uniformément avec 15N pour observer tous les amides (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) ou par addition d’acides aminés spécifiquement marqués (Isogai et al., 2016)., Pour les groupes méthyle, on peut fournir soit des acides aminés correctement marqués, soit des précurseurs d’acides aminés (en particulier des acides alpha-céto) aux milieux de croissance pour accéder à divers modèles de marquage dans les chaînes latérales de plusieurs acides aminés (Kofuku et al., 2014, 2018).,Ind groupes méthyle d’isoleucine δ1 particulièrement utile compte tenu (1) de l’abondance des résidus D’Ile dans les protéines membranaires intégrales, y compris les GPCR (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) du déplacement 13C en champ lointain des groupes méthyle d’isoleucine δ1, les plaçant dans une région particulièrement peu fréquentée de spectres 2D 13C/1H, (3) (4) la présence de multiples liaisons librement rotatives entre le groupe méthyle et L’épine dorsale protéique, fournissant une indépendance substantielle de la dynamique à ces sites (kasinath et al.,, 2013).
bien que bon nombre des stratégies de marquage susmentionnées aient été bien développées pour E. coli, de nombreuses protéines membranaires intégrales ne peuvent être exprimées qu’à des niveaux élevés chez les hôtes eucaryotes. Parmi ceux-ci, la levure méthylotrophe Pichia pastoris est un hôte pratique pour l’expression hétérologue et le marquage isotopique des protéines membranaires eucaryotes (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Les avantages de Pichia comprennent la rapidité de la manipulation génétique, des rendements élevés en protéines recombinantes, l’existence de modifications post-traductionnelles (PTM) et de machines chaperons nécessaires aux protéines membranaires eucaryotes, et la capacité de croître sur des milieux minimaux définis permettant la perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). L’étiquetage isotopique uniforme chez Pichia a été bien établi (Morgan et al., 2000; Pickford & O’Leary, 2004)., Nous avons étendu ce travail en démontrant le marquage 13C, 1h des groupes isoleucine δ1-méthyle dans un fond perdeuteré en ajoutant de l’α-cétobutyrate marqué (marquage~ 50%, deutériation ~ 90%) à des milieux de croissance fortement deutérés (Clark et al., 2017, 2015). En revanche, le marquage simultané des groupes leucine δ – et valine γ-méthyle avec α-cétoisovalérate est inefficace, mais peut être réalisé en ajoutant de la valine marquée directement au milieu de croissance ou en modifiant les conditions de culture (Clark et al., 2015; Suzuki et coll., 2018; Zhang et coll., 2017)., Pichia peut facilement absorber des acides aminés supplémentaires dans les milieux, avec une corrélation générale entre l’efficacité de l’absorption et le coût énergétique de la synthèse de cet acide aminé de type novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Cependant, après absorption dans les cellules, les acides aminés marqués peuvent être introduits dans les voies métaboliques (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), diluant le signal des acides aminés souhaités et compliquant l’analyse des données par brouillage isotopique., Alternativement, des souches auxotrophes peuvent être développées pour marquer un acide aminé spécifique; cependant, il faut prendre soin de confirmer que des effets hors cible dans d’autres voies métaboliques ne se produisent pas (Whittaker, 2007).
ici, nous fournissons des protocoles détaillés nécessaires pour générer de telles protéines membranaires intégrales marquées U-2h (13C, 1h-Ile δ1 méthyl) par surexpression dans Pichia, en utilisant le récepteur de l’adénosine A2A humaine comme système modèle., Nous détaillons plus en détail comment de tels échantillons peuvent être utilisés dans des études de RMN en solution, de l’acquisition de spectres HMQC 13C/1h simples, en passant par des affectations de déplacement chimique par mutagenèse dirigée sur site, à des analyses de mesures de relaxation croisée 1H-1H de la dynamique de la chaîne latérale rapide.